表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)是一种含有53个氨基酸多肽单链小分子,分子量约为6.2kD。EGF对各种细胞增殖和表皮组织生长有很强的促进作用,在医学上已用于烧伤烫伤各类创伤、溃疡和角膜损伤等很多方面的治疗。此外,EGF还能促进正常表皮细胞的新陈代谢,作为化妆品添加剂添加到美容护肤品中可以达到美白、抗皱、延缓衰老的作用,因此不论是作为医疗药品还是化妆品添加剂EGF都具有巨大的潜在应用价值和广阔的市场前景。然而研究表明,EGF的透皮率很低,以0.5μg·g-1的剂量涂抹12h后累积透皮率也仅有0.993%,这说明绝大部分的EGF未能透过皮肤,其透皮吸收效果十分微弱。本课题首先利用PCR技术从人乳腺癌细胞MDA-MB-231的cDNA扩增获得了EGF基因,然后通过重叠PCR技术将EGF基因和细胞穿膜肽Pep-1的DNA片段拼接在一起,分别插入到载体pGEX-6P-3中,构建了携带GST标签的EGF及EGF-Pep-1 (P-EGF)融合表达质粒,并转入大肠杆菌中进行诱导表达；经优化确定最适合表达这两种蛋白的大肠杆菌菌株为BL21-TrixB (DE3)。确定重组蛋白可溶性表达量的最优发酵培养基及发酵条件为：rhEGF蛋白的最适培养基为LB基础培养基,发酵条件为：温度20℃、转速200 rpm、诱导剂IPTG浓度0.4 mmol/1、时间10 h; P-EGF的最适培养基为含1%葡萄糖的M9培养基,发酵条件为：温度20℃、转速200 rpm、诱导剂浓度0.2 mmol/1、时间8 h。表达后的蛋白先利用亲和层析技术进行分离纯化,然后用TEV酶4℃过夜消化切除GST融合标签,最后用离子交换色谱技术纯化获得目的蛋白,并经Western blot验证后,分别利用MTT法和细胞划痕实验检测蛋白的生物活性,结果显示重组蛋白rhEGF和P-EGF均能促进COS-7成纤维细胞的增殖和迁移。免疫荧光分析也证实Pep-1的融合表达能够显著提高EGF穿过细胞膜的能力。本研究成功构建了EGF独立及与穿膜肽Pep-1融合表达的重组大肠杆菌表达系统,为EGF更好的应用于临床及化妆品提供了新的理论指导,并为其开发生产奠定了一定的基础。