番茄细菌性溃疡病(Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis,Cmm)是严重危害番茄的细菌性病害,主要靠带菌种子进行远距离传播,被许多国家列为检疫病害。在口岸检疫及种子种苗健康检测中,传统的分离培养、生理生化鉴定、噬菌体检测、免疫荧光染色及寄主致病性试验等是研究者一直采用的方法。这些检验方法存在很多局限性,不适合口岸检疫快速验放的要求。因此,快速、灵敏、特异性强的PCR 技术近年来被广泛应用于植物病原菌的检测。但常规PCR 技术需很多后续处理,也容易造成实验室及PCR 产物的污染。TaqMan 实时荧光PCR 技术是在普通PCR 基础上加入一条TaqMan探针,该探针能在PCR 的每个循环与靶序列进行特异性杂交,有效提高反应特异性和灵敏度,更好地避免假阴性结果,使PCR 技术检测痕量样品的能力进一步加强。本研究依据番茄细菌性溃疡病菌ITS序列的多态性设计TaqMan 探针及特异性引物,分别对该病菌进行常规PCR 及实时荧光PCR 检测。特异性引物及TaqMan探针能检测出所有供试的Cmm 菌,其它对照菌均无电泳条带也未收集到荧光信号,显示出该引物-探针组合有很强的特异性。通过对不同浓度菌悬液的常规PCR 和实时荧光PCR 扩增,发现实时荧光PCR 检测灵敏度比常规PCR 高约100 倍,能很好地避免假阴性结果。以接种但未显示症状的番茄苗叶片提取核酸作为模板,常规PCR 方法能在接种后第6 天检测到该菌,而实时荧光PCR 则可以在接种后第4 天就检测到该菌的存在。通过对人工模拟带菌种子的测试发现,番茄种子的核酸作为模板对PCR 扩增不存在抑制作用或抑制作用微弱,完全可以通过实时荧光PCR 技术获得准确的试验结果。将带菌种子浸泡液及带菌种子的核酸作为模板进行PCR 扩增,实时荧光PCR 的相对灵敏度明显高于常规PCR,而且经过比较得出,应用种子核酸作为模板能到达更好的检测效果。本研究可直接应用植物总DNA作为试验材料,无需进行病原菌的分离培养及性状观察。由于采用光电传导系统和计算机操作系统能够很直观地反映出整个PCR 过程各个反应阶段的信息,而且不需要进行PCR 产物的后续处理,可以提高检测效率,减少污染。本研究在国内首次建立了对Cmm 的TaqMan实时荧光PCR 检测体系,并获得很好的检测结果。该方法快速、灵敏、特异、安全,能及早提供准确的病害信息,为农业生产部门、检疫部门及种子种苗相关领域提供有力的技术支持。