低分子量姬松茸多糖的分离纯化、结构分析及抗肿瘤活性研究

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姬松茸(Agaricus blazei Murill)是一种珍贵的食药兼用的真菌,目前我国是世界最大的产出国。姬松茸多糖含量居食用蕈菌之首,它的研究开发有利用于姬松茸的综合利用。本文以姬松茸菌柄为原料,超滤制备得到低分子量姬松茸多糖,并对其分离纯化、结构分析和抗肿瘤活性进行了研究,结果如下:1、采用热水提取姬松茸柄粉中的水溶性多糖,经酶结合Sevag法脱蛋白,中空纤维素膜组件超滤,选择性地截取分子量在10-100kDa范围内的低分子量姬松茸粗多糖(LAP),其得率为21.18%,多糖含量为87.33%,蛋白含量为4.46%。2、利用DEAE-52离子交换层析对LAP进行分离纯化,其最佳洗脱条件为:NaCl梯度洗脱浓度0moL/mL→0.05moL/mL→0.1moL/mL→0.2moL/mL,流速1.6mL/min,上样浓度20mg/mL(上样体积为柱体积的5%,约5mL)。此条件下可得到四种多糖级分LAP-1、LAP-2、LAP-3和LAP-4,分别占LAP总量的8.09%、77.76%、9.62%、4.54%。3、分析四种级分多糖的理化性质,结果显示LAP-1~4多糖含量分别为89.27%、90.92%、86.45%、67.63%,其中LAP-3和LAP-4含有少量的蛋白,LAP-1和LAP-2不含蛋白。四种级分多糖均为非淀粉类多糖,不含还原糖及酚类物质。气相色谱(GC)结果显示,LAP-1主要由阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成;LAP-2主要由葡萄糖和半乳糖组成’LAP-3和LAP-4主要由葡萄糖组成,还含有少量的阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖等。凝胶过滤层析鉴定四种级分多糖的纯度,结果表明四种多糖都是非均一性多糖,需进一步纯化。4、选取LAP中的主要成分LAP-2,利用Sephadex G100对LAP-2做进一步分离纯化,其最佳凝胶分离条件为:上样浓度4mg/mL,上样体积5mL,洗脱剂为0.15mol/L NaCl,流速为1.OmL/min。此条件下,收集得到亚级分多糖组分LAP-2-I。经纯度鉴定,LAP-2-I为单一组分。5、理化分析显示,LAP-2-I为白色絮状粉末,溶于水,易溶于热水,不溶于乙醇、正丁醇、氯仿、丙酮、乙酸乙酯等有机溶剂。比旋度[α]D25为+19.3°,多糖含量为92.5%,不含蛋白和核酸。红外(IR)、气相色谱(GC)以及高碘酸氧化和Smith降解结果表明,LAP-2-I具有a-D-吡喃葡萄糖的特征吸收,主要是通过1→、1→6位和1→4、1→4,6位键合的葡萄糖残基形成的一种葡聚糖,并含有一定数量的1→3糖苷键和少量的1→2、1→2,4糖苷键。X衍射结果表明,LAP-2-I中含结晶性的多糖或多糖复合物极少,分子规整性不强,处于无定形的状态。刚果红结果显示,LAP-2-I无三股螺旋结构。6、对胃癌细胞SGC-7901体外抗肿瘤活性表明,低分子量姬松茸多糖能抑制SGC-7901细胞的增殖,并呈一定的剂量依赖关系,并能促进SGC-7901细胞凋亡。经多级纯化后,低分子量姬松茸多糖对SGC-7901细胞增殖的抑制作用和细胞诱导凋亡能力均有所降低,这可能与粗多糖中存在的各组分多糖之间的协同作用有关,但其构效关系尚需进一步研究。7、对结肠癌细胞DLD-1的体外抗肿瘤活性研究表明,低分子量姬松茸多糖对DLD-1生长有一定的抑制作用,但作用效果不明显,且无明显的诱导凋亡作用。
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