前言肺癌是严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一，且发病率和死亡率居高不下。肺癌患者生存率的提高在于早期诊断和及时适当的治疗，而早期诊断是关键。由于患者出现临床症状和检查发现肿块形成多已进入中晚期，故寻找与肺癌发生相关的肿瘤标志物被认为是早期诊断的有效方法。近年来的研究发现，正常人血浆中存在少量游离DNA。肿瘤患者不仅血浆中游离DNA含量增多，而且能在一定程度上反应肿瘤细胞的某些生物学特点，如甲基化、畸变等。血浆取材方便，相对无创，患者易于接受，故血浆肿瘤标志物检测，可能有利于肺癌的早期诊断。RASSF1A是新近发现的候选肺癌抑癌基因，定位于3p21.3。研究表明，90％以上的小细胞肺癌及50％～80％的非小细胞肺癌该区域纯合性或杂合性丢失，据此推测，该基因可能是对肺癌特异的一种抑癌基因。国外已有的研究表明，RASSF1A在肺癌等肿瘤中存在较高的缺失率，其表达失活的主要原因是启动子区CpG岛的高甲基化，国内此类研究甚少。p16又称多肿瘤抑制基因，定位于9p21，在肺癌组织中频繁失活，与肺癌的发生、发展关系密切。该基因在肺癌中失活的主要原因也是启动子区高甲基化，且这种甲基化改变能在癌症患者的血浆游离DNA中探知。肺癌的发生、发展和转归是一个极其复杂的多阶段、多因素调控异常的过程，而抑癌基因甲基化改变是肿瘤发生的早期分子事件。假如中国人肺癌中两基因也存在一定的缺失率，其表达失活的主要原因也为启动子CpG岛甲基化，而这种改变又能在肺癌患者的血浆游离DNA中检测到，且血浆游离DNA能够较好的反应肺癌组织中两基因甲基化状态，那么，联合检测血浆游离DNA中两基因CpG岛甲基化将有利于肺癌的早期诊断。RASSF1A的抑癌机制尚不清楚。借助比较蛋白质组学研究方法，可以观察RASSF1A失活后引起的效应和调节蛋白的变化，更加深入了解RASSF1A的作用和探讨抑癌机制。目的1．检测中国人非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)组织中RASSF1A和p16基因失活和启动子CpG岛高甲基化情况，探明两基因在NSCLC中失活的主要机制；分析NSCLC患者血浆游离DNA中RASSF1A和p16基因启动子CpG岛高甲基化与癌组织中两基因甲基化的相关性，探索联合检测血浆中两基因异常甲基化用于NSCLC诊断的价值。2．建立RASSF1A表达或表达缺失的两类不同肺腺癌组织中蛋白质双向电泳凝胶图谱，并从中筛选差异显示蛋白质点，质谱鉴定出差异显示蛋白，通过差显蛋白功能分析，为进一步研究RASSF1A的抑癌途径奠定初步基础。材料与方法1．研究对象与分组以96例NSCLC患者的癌组织和血浆为研究对象，以相匹配的远癌正常肺组织、12例肺良性病变患者和20例健康志愿者的血浆为对照。2．研究方法2．1 NSCLC组织中RASSF1A和p16基因表达失活情况研究2．1．1 RASSF1A和p16基因转录观察从NSCLC组织和相配的远癌正常肺组织中提取总RNA逆转录合成cDNA，以此cDNA为模板PCR扩增RASSF1A和p16基因片断，观察两基因的转录情况。结合病人的临床资料和肿瘤病理特征分析，卡方检验比较两基因转录失活与NSCLC患者临床资料和肿瘤病理特征的关系。2．1．2 RASSF1A表达观察从NSCLC组织和相配的远癌正常肺组织中提取总蛋白，BradFord法测定样品的蛋白质浓度，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。转膜后，抗原抗体反应，DAB试剂盒显色，观察RASSF1A的表达情况。2．2 NSCLC患者血浆与组织中RASSF1A和p16基因启动子甲基化研究2．2．1组织和血浆DNA的提取和修饰按照组织和血浆DNA提取试剂盒说明，分别提取患者肿瘤组织、远癌正常肺组织和血浆DNA，以及良性肺部疾病和健康自愿者的血浆DNA，紫外分光光度计下定量。用CpG岛甲基化酶(M．SssⅠ)修饰50μg胎盘DNA。将1.2μg组织DNA或600μl血浆提取的45μl血浆游离DNA进行亚硫酸氢盐修饰。2．2．2扩增引物特异性的检测PCR和甲基化特异性PCR分别扩增M．SssⅠ修饰、未经修饰的胎盘组织DNA中野生型(W)，甲基化(M)和未甲基化(U)的RASSF1A和p16基因，检测引物的特异性。2．2．3组织RASSF1A和p16基因甲基化检测PCR和甲基化特异性PCR分别扩增组织DNA中野生型，甲基化和未甲基化的RASSF1A和p16基因，探测RASSF1A和p16基因在癌组织和相配的远癌正常肺组织DNA中甲基化情况；结合病人的临床资料和肿瘤病理特征分析，卡方检验比较两基因甲基化与非小细胞肺癌患者临床资料和肿瘤病理特征的关系；Spearman相关分析法分析两基因高甲基化与其转录表达之间的相关性，探明中国人NSCLC组织中两基因失活的主要机制。2．2．4血浆RASSF1A和p16基因甲基化检测半巢式甲基化特异性PCR分别扩增血浆游离DNA中甲基化和未甲基化的RASSF1A和p16基因。Spearman相关分析法分析血浆和肿瘤组织中两基因高甲基化的相关性，决定血浆中两基因甲基化改变能否代替肿瘤组织中两基因的甲基化状态。2．2．5诊断效力指标检验血浆游离DNA中两基因甲基化联合检测诊断非小细胞肺癌的敏感性、特异性、阴性预测值和阳性预测值。2．3．RASSF1A表达或表达缺失的两类不同肺腺癌组织中差显蛋白的鉴定2．3．1组织可溶性总蛋白的提取用双向电泳蛋白裂解液提取RASSF1A表达或缺失的两类肺腺癌组织总蛋白，BradFord法测定样品的蛋白质浓度，作为分析型凝胶和制备型凝胶上样量的依据。2．3．2差显蛋白的筛选以17cm胶条分析型银染凝胶蛋白上样量标准上样后双向电泳，图像扫描软件GS-800扫描，获取两类肺腺癌组织17cm银染的凝胶图像，PDQuest7.1分析软件分析，找出差显蛋白点。2．3．3差异蛋白的质谱鉴定以17cm胶条制备型考染凝胶蛋白上样量标准上样后双向电泳，获取这些差异表达的蛋白质点，胶内酶解后，经基质辅助电离解吸飞行时间质谱，获得肽质量指纹图谱，搜索蛋白质数据库，联合生物信息学，鉴定出蛋白质，分析其生物学功能，探索与RASSF1A之间的联系。3．统计学处理应用SPSS12.0统计分析软件，采用x~2检验，Spearman相关分析，以α=0.05为检验水准。结果1．NSCLC组织中RASSF1A和p16基因表达失活情况1．1转录失活情况在NSCLC组织中，RASSF1AmRNA表达明显下调和缺失率为53.12％(51／96)，p16基因mRNA表达下调和缺失率为36.46％(35／96)，而相应的远癌正常肺组织均表达良好。RASSF1AmRNA表达与患者的性别、年龄、是否吸烟及肿瘤的组织学类型和分化程度无关(P＞0.05)；与肿瘤的TNM分期和有无淋巴结转移有关(P＜0.05)；p16转录本的表达与患者是否吸烟及肿瘤的分化程度无关(P＞0.05)；但与患者的年龄、性别，肿瘤的组织学类型、TNM分期和有无淋巴结转移均有关(P＜0.05)。1．2表达失活情况NSCLC患者肿瘤组织中60.4％(58／96)RASSF1A表达明显下调和缺失，而相应的远癌正常肺组织均表达良好。2．NSCLC患者血浆与组织中RASSF1A和p16基因启动子甲基化情况2．1 DNA的质量和含量提取的组织和血浆DNAA260／A280≈1.76～1.80，质量较好。非小细胞肺癌患者血浆游离DNA含量远高于肺良性病变患者和健康人。2．2引物特异性检测RASSF1A和p16基因W、M和U三种引物对提取的胎盘DNA进行PCP扩增，仅引物W扩出目的条带；对M. SssⅠ处理和未处理的胎盘组织DNA进行碱基修饰，W、M、U三种引物甲基化特异性PCR扩增，前者仅能扩出目的条带M，而后者仅能扩出U，表明引物特异性好。2．3组织RASSF1A和p16基因甲基化分析NSCLC患者肿瘤组织RASSF1A甲基化检出率为48.96％(47／96)，p16甲基化检出率为34.38％(33／96)。96例相配的远癌正常肺组织中未检测到两基因有异常甲基化。RASSF1A甲基化率与肿瘤的组织学类型有关，其中鳞癌组大于腺癌组(P＜0.05)，但与患者的年龄、性别、是否吸烟及肿瘤的分化程度、TNM分期和有无淋巴结转移均无关(P＞0.05)。p16基因甲基化率50岁以上组高于50岁以下组，鳞癌高于腺癌，有淋巴结转移组高于无淋巴结转移组(P＜0.05)，但与患者的性别、是否吸烟，肿瘤的分化程度及TNM分期无关；RASSF1A和p16基因的转录与两基因启动子区CpG岛高甲基化呈显著负相关(RASSF1A：r_s=-0.586，P＜0.0001，p16：r_s=-0.363，P＜0.0001)RASSF1A的表达与该基因启动子区CpG岛高甲基化也呈显著负相关(r_s=-0.793，P＜0.0001)。表明启动子CpG岛高甲基化是中国人NSCLC组织中两基因失活的主要原因。2．4血浆RASSF1A和p16基因甲基化分析经半巢式甲基化特异性PCR二次扩增，NSCLC患者血浆中RASSF1A甲基化检出率为43.75％(42／96)，p16甲基化检出率为31.25％，12例肺良性病变患者、20例健康人血浆中均未检测到两基因有异常甲基化；NSCLC患者血浆和肿瘤组织中RASSF1A与p16基因启动子CpG岛甲基化存在着极好的相关性(r_s=0.932，P＜0.000)。表明血浆中两基因甲基化改变能够很好的反应肿瘤组织中两基因的甲基化状态。2．5血浆游离DNA中RASSF1A或p16基因异常甲基化对NSCLC的诊断意义单独检测血浆游离DNA中RASSF1A或p16基因异常甲基化用于诊断NSCLC的敏感性分别为43.75％(42／96)和31.25％(30／96)，特异性均为100％(38／38)，阴性预测值分别为41.30％(38／92)和36.54％(38／104)，阳性预测值均为100％(42／42，30／30)。此两项指标联合检测诊断NSCLC敏感性提高到59.38％(57／96)，阴性预测值为49.35％(38／77)。3．RASSF1A表达和表达缺失的两类不同肺腺癌组织中差显蛋白鉴定3．1差显蛋白筛选结果成功获取了RASSF1A表达和表达缺失的两类不同肺腺癌组织17cm银染的凝胶图像，PDQuest7.1分析软件分析，找出存在明显表达差异的蛋白点9个。3．2差显蛋白质谱鉴定结果从17cm制备型考染胶上成功获取了这些差异表达的蛋白质点，质谱鉴定出5种尚未见与RASSF1A相关报道的蛋白质，分别是：细胞色素B5(Cytochrome b5)，60S磷酸核糖体蛋白P2(60S acidic ribosomal protein P2)，碳酸酐酶-1(Carbonic anhydrase 1)，5-吡咯啉羧酸还原酶Ⅰ(Pyrroline-5-carboxylate reductase 1)和载脂蛋白A-Ⅰ前体蛋白(Apolipoprotein A-Ⅰprecursor)。另4个蛋白质点，虽获得了满意的肽指纹图谱，但在现有的蛋白质库中没有匹配上合适的蛋白质，有待通过串联质谱或氨基酸序列分析的方法做进一步的鉴定。结论1．RASSF1A和p16基因在本组中国人NSCLC组织中存在着较高的转录缺失率，RASSF1A在该组织中也较高比率的表达失活，而在正常肺组织中均表达良好。2．RASSF1A和p16基因在本组NSCLC组织中较高频率的甲基化，且与其表达失活显著相关，甲基化改变是其失活的主要原因；NSCLC患者的血浆游离DNA中可以检测到两基因的甲基化改变，且与相应的癌组织中两基因的甲基化状态存在极好的相关性。联合检测血浆中两基因高甲基化有助于NSCLC的早期诊断。3．成功建立了RASSF1A表达和RASSF1A表达缺失的两类不同肺腺癌组织的蛋白质双向电泳凝胶图谱，发现9个差显蛋白点。质谱鉴定出5种尚未见其与RASSF1A相关性报道的蛋白质，分别是：细胞色素B5(Cytochrome b5)，60S磷酸核糖体蛋白P2(60S acidic ribosomal protein P2)，碳酸酐酶-1(Carbonic anhydrase 1)，5-吡咯啉羧酸还原酶Ⅰ(Pyrroline-5-carboxylate reductase 1)和载脂蛋白A-Ⅰ前体蛋白(Apolipoprotein A-Ⅰprecursor)。