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第一部分白细胞介素-7对结核分枝杆菌抗原持续刺激致骨髓造血功能异常的作用研究造血干细胞与造血祖细胞通过自我更新、增殖、分化,生成淋巴细胞等免疫细胞以满足机体抗感染免疫的需求。机体发生感染时,会产生IFN-γ、TNF-α等炎性细胞因子,调节造血干细胞的增殖与分化。在感染初期,炎症细胞因子会促进造血干细胞的增殖并促进向髓系分化,以补充外周血中消耗的单核细胞与粒细胞;但若感染持续时间过长且无法清除,炎症细胞因子的长期刺激会导致造血干细胞的功能失调乃至衰竭,引起骨髓造血功能障碍和外周血全血细胞数目的减少。结核病是由结核分枝杆菌感染引起的慢性传染性疾病。严重结核病患者存在不同程度的淋巴细胞减少的表现。淋巴细胞减少的机制除了结核分枝杆菌感染引起外周淋巴细胞死亡,还与感染导致的骨髓造血功能异常有关。我们实验室前期研究发现大剂量卡介苗（BCG）入血感染及结核分枝杆菌抗原持续刺激会导致骨髓造血干细胞与造血祖细胞中髓系分化相关转录因子表达增加,淋巴系分化相关转录因子表达减少,外周血淋巴细胞数目减少。应用IL-2治疗可以促进造血干细胞增殖,增加淋巴系分化转录因子的表达,升高外周血淋巴细胞数目。为了进一步了解重症结核病中骨髓造血功能异常的调控因素,本课题研究白细胞介素-7（Interleukin-7,IL-7）和黄连素（berberine）对淋巴细胞减少及骨髓造血的调节作用。IL-7是骨髓中淋巴细胞发育的关键细胞因子,参与骨髓淋巴细胞生成并维持T细胞稳态。黄连素是具有广泛抗炎活性的小分子药物,可以有效抑制机体的炎症反应。目的:应用结核分枝杆菌抗原刺激模型,研究IL-7与黄连素对结核分枝杆菌抗原致淋巴细胞低下的干预作用,分析IL-7与黄连素干预能否抑制结核抗原持续刺激引起的炎症反应,改善骨髓造血干细胞与造血祖细胞的分化异常,逆转外周血淋巴细胞低下。方法:（1）对C57BL/6小鼠尾静脉注射大剂量BCG（5×10~7CFU/只）及皮下注射结核分枝杆菌抗原持续刺激,引起外周血淋巴细胞低下及骨髓造血功能异常,构建结核分枝杆菌抗原刺激模型。抗原刺激后主要通过检测以下指标反映抗原刺激对骨髓造血功能及淋巴细胞的影响:（1）检测外周血淋巴细胞数目;（2）ELISA检测血清与骨髓中IFN-γ、TNF-α、IL-7的水平;（3）磁珠分选骨髓LK（Lineage-c-kit+）细胞并通过RT-PCR检测分化相关转录因子Batf2、Irf8、E2a的表达情况;（4）流式细胞术检测小鼠骨髓中淋巴系祖细胞（Lineage-c-kit+CD127+）的比例。（2）通过r AAV-IL-7对结核分枝杆菌抗原刺激模型进行干预,以r AAV-EGFP作为对照。检测指标同上。（3）通过20、40、80mg/kg剂量的黄连素对结核分枝杆菌抗原刺激模型进行干预,流式细胞术检测脾脏T淋巴细胞表面抑制性受体PD-1的表达,其余检测指标同上。结果:（1）建立结核分枝杆菌抗原持续刺激致骨髓造血功能低下的病理模型:大剂量BCG感染及持续结核分枝杆菌抗原刺激会引起小鼠强烈的炎症反应,血清中IFN-γ、TNF-α水平升高,IL-7水平降低,骨髓中IFN-γ水平升高;骨髓LK细胞中髓系分化相关转录因子Batf2、Irf8表达升高,并抑制淋巴系分化相关转录因子E2a的表达,骨髓造血干细胞偏向髓系分化。与PBS对照组（2.29±0.68?）相比,抗原持续刺激组淋巴系祖细胞占骨髓细胞的比例（0.56±0.11?）显著降低（p＜0.01）。同时,与PBS对照组的外周血淋巴细胞数目（7.32±0.88×10~9/L）相比较,抗原持续刺激组（1.67±0.39×10~9/L）外周血淋巴细胞数目明显降低（p＜0.01）。（2）r AAV-IL-7对结核分枝杆菌抗原刺激模型的干预:r AAV-IL-7干预可以升高血清中IL-7水平,降低血清中IFN-γ、TNF-α的水平,并促进骨髓LK细胞中淋巴系分化相关转录因子E2a的表达。r AAV-IL-7干预组骨髓中的淋巴系祖细胞比例（4.46±1.40?）较抗原持续刺激组（0.56±0.11?）显著升高（p＜0.01）。r AAV-IL-7干预组外周血淋巴细胞数目（3.64±1.15×10~9/L）较抗原持续刺激组（1.67±0.39×10~9/L）显著升高（p＜0.01）。（3）黄连素对结核分枝杆菌抗原刺激模型的干预:40mg/kg的黄连素干预可以降低血清与骨髓中IFN-γ的水平,黄连素干预组脾脏细胞中CD4+PD-1+细胞的比例（0.94±0.13%）较抗原持续刺激组（3.05±0.88%）显著降低（p＜0.01）,黄连素干预组脾脏细胞中CD8+PD-1+细胞的比例（0.45±0.12%）较抗原持续刺激组（1.34±0.52%）显著降低（p＜0.01）。骨髓LK细胞中髓系分化相关转录因子Batf2、Irf8的表达降低,骨髓中的淋巴系祖细胞比例增多。黄连素干预组外周血淋巴细胞数目（4.32±1.10×10~9/L）较抗原持续刺激组（1.67±0.39×10~9/L）显著升高（p＜0.01）。结论:（1）大剂量BCG入血感染及结核分枝杆菌抗原持续刺激会诱导小鼠血清与骨髓中IFN-γ增高,促进骨髓造血干细胞与造血祖细胞中髓系分化转录因子升高,骨髓中淋巴祖细胞减少,外周血淋巴细胞数目减少。（2）r AAV-IL-7干预可以促进血清IL-7升高,血清中IFN-γ、TNF-α水平降低,促进骨髓中淋巴系祖细胞增加,外周血淋巴细胞数目增加。（3）黄连素干预降低血清与骨髓中IFN-γ水平,降低脾脏T淋巴细胞PD-1表达,外周血淋巴细胞数目增加。第二部分结核分枝杆菌融合蛋白LT29的规模化制备结核蛋白亚单位疫苗是一类选择结核分枝杆菌保护性抗原构建的疫苗。与减毒活疫苗与灭活疫苗相比,蛋白亚单位疫苗成分明确,副作用小。本课题组前期筛选出结核分枝杆菌抗原ESAT6与Rv2626c,将二者融合构建为结核分枝杆菌融合蛋白LT29,并通过5ml柱体积的疏水层析柱Butyl Sepharose High Performance与离子层析柱DEAE Sepharose Fast Flow纯化获得纯度大于95%的蛋白。对LT29的免疫原性进行评价,发现该融合蛋白可以诱导较强的细胞免疫与体液免疫反应,是良好的候选结核亚单位疫苗。目的:在前期建立的结核分枝杆菌融合蛋白LT29小规模制备方法的基础上,建立更大规模的纯化体系,以满足融合蛋白中试的要求。方法:（1）规模化纯化方法探索:（1）应用大肠埃希菌菌BL21表达系统表达融合蛋白LT29;（2）首先通过不同比例饱和硫酸铵溶液的盐析进行初步纯化;（3）利用AKTA avant蛋白纯化仪,以50ml柱体积的疏水层析柱Butyl Sepharose High Performance吸附后不同比例的PB缓冲液与高盐PB缓冲液洗涤杂蛋白与目的蛋白进行第二步纯化;（4）利用AKTA avant蛋白纯化仪,以25ml柱体积的离子层析柱DEAE Sepharose Fast Flow吸附后不同比例的PB缓冲液与高盐PB缓冲液洗涤目的蛋白进行第三步纯化;（5）通过SDS-PAGE电泳确定蛋白纯度。（2）疫苗免疫保护效率初步评价:以LT29/DPC在0-4-12周腹股沟皮下免疫小鼠三次,末次免疫12周后,通过结核分枝杆菌减毒株H37Ra菌株（5×106 CFU/只）尾静脉注射攻击小鼠,以菌株攻击三周后小鼠脾脏与肺脏的菌载量反映融合蛋白LT29对结核分枝杆菌感染的保护效果。结果:（1）大肠埃希菌BL21可高效表达融合蛋白LT29;LT29通过30%饱和硫酸铵盐析进行初步纯化;疏水层析柱Butyl Sepharose High Performance吸附后,以100%的PB缓冲液洗涤杂蛋白,dd H2O洗脱目的蛋白进行第二步纯化;离子层析柱DEAE Sepharose Fast Flow吸附后,以80%的PB缓冲液加20%的高盐PB缓冲液洗脱目的蛋白进行第三步纯化,可以获得纯度大于95%的融合蛋白LT29,成功建立了较大规模的纯化方法。（2）通过结核分枝杆菌减毒株H37Ra菌株的攻击实验,证实融合蛋白LT29存在一定的保护效果。结论:成功建立了较大规模的LT29的纯化方法,通过盐析、疏水层析、离子层析三步纯化得到了纯度大于95%的结核分枝杆菌融合蛋白LT29。