论文部分内容阅读
背景:Cajal间质细胞（interstitial cells of Cajal, ICC）是胃肠道的起搏细胞,具有产生、传播慢波的功能,参与调控肠神经信号传导。现已证明慢传输性便秘等众多胃肠动力紊乱性疾病都存在ICC数目减少。新近的研究提示ICC发生平滑肌细胞样表型转化（而非凋亡）可能是众多胃肠动力紊乱性疾病ICC减少的共同机制。ICC细胞膜特异性表达酪氨酸激酶受体（c-kit）,与其配体干细胞因子（stem cell factor, SCF）结合后所启动的SCF/c-kit信号通路,对ICC发育、分化及胃肠道节律性活动的稳定至关重要。干细胞白血病（stem cell leukemia, SCL）基因编码螺旋-环-螺旋类转录因子,是c-kit上游的重要调控基因,通过作用c-kit基因启动子调节c-kit表达来发挥其“生存基因”的功能,具有强烈的促c-kit表达作用。我们的前期研究发现,转SCL基因可以在细胞以及组织培养条件下上调c-kit表达,联合SCF应用,恢复SCF/c-kit信号通路,促进ICC平滑肌细胞样表型逆转恢复。因此推测在体SCL转基因亦可通过上调c-kit表达,联合SCF应用,恢复SCF/c-kit信号通路,促进ICC平滑肌细胞样表型逆转恢复。为此,本研究构建表达SCL基因的重组腺病毒Ad-SCL,联合应用SCF,在体探讨SCL转基因联合SCF对Cajal间质细胞恢复的影响及机制。为今后深入探讨促ICC恢复及其机制奠定基础。目的:1.快速构建并鉴定含有人SCL基因的重组腺病毒Ad-SCL;2.细胞及在体水平观察重组腺病毒Ad-SCL转染效率及生物安全性; 3.观察重组腺病毒Ad-SCL联合SCF应用对ICC恢复的作用。方法:1.采用亚克隆技术将人SCL基因片断定向克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV上,获得重组质粒pAdTrack-CMV/SCL。Pme I线性化后转化包含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183菌。同源重组后筛选阳性克隆,用脂质体介导转染293细胞,绿色荧光蛋白观察以及PCR鉴定获得的重组腺病毒Ad-SCL。2.用不同MOI的重组腺病毒Ad-SCL转染Hela细胞株,确定最佳病毒转染MOI;用最佳MOI的重组腺病毒Ad-SCL转染Hela细胞株,用MTT细胞增殖实验观察对Hela细胞生长的影响;用RT-PCR法检测重组腺病毒Ad-SCL介导的SCL mRNA在Hela细胞以及体外培养的ICC中的表达;经ICC缺失模型Balb/c小鼠尾静脉注射1.6×109PFU的重组腺病毒Ad-SCL,在不同的时相点（2d、7d、15d、30d）检测重组腺病毒在小鼠心、肺、肝、脾、肾、小肠及大肠组织内的分布和表达;HE染色法观察重组腺病毒的体内毒性;RT-PCR法分析重组腺病毒介导的SCL mRNA在各脏器内的表达。3.取ICC缺失模型Balb/c小鼠,经尾静脉注射1.6×109 PFU的重组腺病毒Ad-SCL,Western Blot检测注射后2d、7d、15d、30d结肠肌条c-kit蛋白的表达;取ICC缺失模型Balb/c小鼠,经尾静脉注射1.6×109 PFU的重组腺病毒Ad-SCL以及SCF（30μg/kg,连续腹腔注射5d）后7d、14d、21d、28d,免疫组化染色以及超微结构观察ICC在结肠的分布及数量的变化。结果:1.酶切法以及PCR法证实利用同源重组法成功地构建了含有人SCL基因的重组腺病毒载体,经脂质体转染试剂转染293细胞,获得重组腺病毒Ad-SCL。病毒滴度测定可达1.6×1011pfu/ml。2.制备的重组腺病毒Ad-SCL对Hela细胞株以及体外培养的ICC具有很强的转染效率。当MOI为50时,对Hela细胞的转染效率为（90±1.825）%,当MOI为90时,对Hela细胞的转染效率为（98.5±1.290）%。MTT细胞增殖实验证实重组腺病毒Ad-SCL对Hela细胞生长没有影响。RT-PCR证实重组腺病毒Ad-SCL可以介导SCL基因在Hela细胞以及体外培养的Cajal间质细胞中表达。3.重组腺病毒Ad-SCL在体应用时,在ICC缺失模型鼠体内有广泛的分布;2d时绿色荧光蛋白表达最明显,30d最弱;RT-PCR法证实在体应用重组腺病毒Ad-SCL后30d,在ICC缺失模型鼠结肠肌条内仍然可以检测到SCL mRNA的表达。4.HE染色法显示在体应用重组腺病毒Ad-SCL后,ICC缺失模型鼠结肠等脏器无明显损伤表现。5.Western blot检测显示,在体应用重组腺病毒Ad-SCL后,可以明显上调ICC缺失模型鼠结肠肌条的c-kit蛋白的表达,2d可检测到、7d最明显、15d下降、30d恢复正常水平。6.免疫组化染色以及超微结构观察显示在重组腺病毒Ad-SCL和SCF联合应用后14d,ICC缺失模型鼠结肠内ICC-MP最先得到部分恢复;21d时, ICC-CM、ICC-LM以及ICC-SMB均得以部分恢复;28d时,ICC-MP、ICC-CM、ICC-LM以及ICC-SMB得到完全恢复。7.单纯重组腺病毒Ad-SCL应用或单纯SCF应用,免疫组化染色以及超微结构观察ICC缺失模型小鼠结肠ICC未见明显恢复。结论:1.制备的重组腺病毒Ad-SCL对Hela细胞株、体外培养的Cajal间质细胞以及在体器官均有较强的转染效率,并且可以介导SCL基因在Hela细胞株、体外培养的Cajal间质细胞以及在体器官中表达。有较好的细胞水平以及在体水平的生物安全性。2.制备的重组腺病毒Ad-SCL可以上调ICC缺失模型鼠结肠肌条内c-kit蛋白的表达。其机理可能是通过介导SCL基因的表达增加,转而上调了c-kit蛋白表达。3.联合应用重组腺病毒Ad-SCL和SCF后, ICC缺失模型鼠结肠内ICC得以恢复。联合作用后14d,ICC开始恢复;联合作用后28d,ICC得到完全恢复。单纯腺病毒应用或单纯SCF作用,ICC未见明显恢复。4.重组腺病毒Ad-SCL介导的SCL转基因联合SCF应用可促进ICC缺失模型鼠结肠ICC恢复。其机理可能与恢复了SCF/c-kit信号通路有关。