研究背景食管癌是目前世界范围内常见的上消化道恶性肿瘤,其分布随着地域、种族不同而差异很大。食管鳞状细胞癌(Esophageal Squamous Cell Carcinoma, ESCC)是食管癌的主要病理类型之一,也是我国食管癌的主要病理类型,食管腺癌(Esophageal Adenocarcinoma, EAC)则在欧美国家更常见。目前,局限性食管鳞状细胞癌的治疗首选手术根治性切除,这一观点已达成共识。众所周知,食管癌的预后与肿瘤的TNM分期(Tumor-node-metastasis staging)相关。根据美国国立综合癌症网络(National Comprehensive Cancer Network, NCCN)最新的食管癌治疗指南,对于接受根治性食管癌切除术,且术后病理重新分期确定为pTl-2NOM0的食管鳞癌患者,给予任何的术后辅助治疗都是不恰当的,定期随访即可；而pT3-4aNOM0的食管鳞癌患者,行根治性手术后是否还需进一步接受辅助治疗尚有争议。临床工作中,我们发现很大一部分分期为pN0期的食管鳞癌患者术后出现复发,主要的复发模式是淋巴结转移性复发。同是pN0期的食管鳞癌患者预后差别很大。因此,单纯根据食管鳞癌的TNM分期来判断患者的预后并不十分准确可靠。对术后病理证实为pN0期的食管鳞癌患者,个体化治疗很重要。对于复发风险高的患者,术后适当的辅助治疗对于减少复发风险,改善患者预后有着至关重要的作用。因此,如何筛选出有术后高复发风险的患者人群是我们目前面临的主要问题。有报道某些分子指标可用于预测pN0期食管鳞状细胞癌淋巴结转移性复发,但目前并没有公认的和能够在临床上广泛应用的指标。CEP55 (Centrosomal protein 55)是近来发现的细胞周期调节蛋白。细胞进行有丝分裂时,CEP55的正常调节作用是中心体复制、胞质分裂及最终胞膜分离等细胞功能得以顺利完成的关键。胞质分裂异常可能导致更多的染色体不稳定的多核细胞的出现,从而更容易导致肿瘤的发生,而这些可能与CEP55过表达有关。有报道称CEP55在某些人类肿瘤中存在高表达。研究显示哺乳动物细胞中CEP55高表达可以增加细胞的迁徙及侵袭性,而抑制CEP55的表达可以阻碍癌细胞的生长,增加其凋亡。而在人体正常组织中除了睾丸和胸腺,很少能够检测到CEP55的表达。这些表明CEP55的异常表达可能导致肿瘤发生且与肿瘤的不良预后有关。CEP55在食管鳞癌中的表达及其意义,食管鳞癌细胞系中是否存在CEP55高表达,抑制CEP55的表达后食管鳞癌细胞生物学行为较前有无改变等目前尚无报道。本试验中,我们通过免疫组织化学及Western免疫印迹等技术检测pN0期食管鳞癌组织中CEP55的表达情况,同时回顾患者的临床资料,探讨了CEP55与pN0期食管鳞癌患者临床病理特征之间的关系；并结合食管鳞癌患者的随访资料,探讨了CEP55与pN0期食管鳞癌预后的关系,以求明确CEP55能否作为pN0期食管鳞癌患者预后的判断指标。同时,通过携带CEP55 siRNA的慢病毒转染食管鳞癌Eca109细胞系,阻断CEP55的表达,构建稳定的经RT-PCR和Western Blot检验抑制CEP55表达的Eca109细胞系,检测CEP55表达被抑制前后食管鳞癌细胞的增殖及侵袭能力的变化,从而明确CEP55对食管鳞癌细胞生物学行为的影响,旨在为食管鳞癌的基因治疗靶点的筛选提供理论基础。第一部分CEP55在pN0期食管鳞癌组织中的表达及CEP55表达与食管鳞癌患者临床病理特征之间的相关性研究目的：探讨pN0期食管鳞状细胞癌组织中CEP55的表达情况及CEP55表达与食管鳞癌患者临床病理特征之间的关系方法：本实验中我们选取了2007年1月至2009年12月间在山东大学附属省立医院接受手术治疗的196例胸中段食管鳞癌患者作为研究对象,并收集上述患者的病理标本。标本成对留取,包括典型食管鳞癌组织和癌旁正常食管粘膜。纳入本实验的患者均接受了Ivor-Lewis食管癌根治手术,术后病理证实均为pN0期食管鳞癌。每份标本中CEP55的表达情况通过免疫组化方法及Western免疫印迹法进行检测、验证。同时回顾性分析所有入组患者的临床病理资料。应用SPSS17.0进行数据分析。其中,计量资料应用均数±标准差(x±s)来表示,采用独立样本t检验(方差齐时)或t’检验(方差不齐时)进行两组均数的比较。CEP55表达与患者临床病理特征间的关系应用卡方检验进行分析。P<0.05认为具有统计学差异。结果：CEP55的阳性表达在免疫组化法中表现为细胞浆内出现棕色或黄色颗粒。CEP55在124例(63.3%)入组患者的食管鳞癌标本中表现为阳性表达。癌组织中CEP55的表达水平显著高于癌旁正常的食管粘膜(P<0.001)。Western blot结果显示CEP55表达水平与T分期相关(P<0.05)。通过卡方检验可以看出,CEP55表达与病变长度(P=0.012)、病变浸润深度(P=0.021)及pTNM分期(P=0.010)显著相关,而与其他临床特点无明显相关性。随着肿瘤的增大、肿瘤浸润深度的增加及pTNM分期的进展CEP55阳性表达率显著增高。pT3期食管鳞癌患者中72例(72.7%)患者食管鳞癌标本中检测到CEP55阳性表达。67例(72.8%)病变长度≥3cm的患者食管鳞癌标本中有CEP55阳性表达。术后病理分期为IIB期的患者中,71例(74.0%)患者的食管鳞癌标本中检测到CEP55阳性表达。结论：CEP55在pN0期食管鳞癌中高表达。CEP55高表达与食管鳞癌病变长度、病变浸润深度及其pTNM分期显著相关。CEP55可能与食管鳞癌的发生及侵袭相关。第二部分CEP55与pN0期食管鳞癌患者预后的相关性分析目的：探讨CEP55表达与完整切除术后pN0期食管鳞癌患者预后的关系。方法：本实验中,我们选取了自2007年1月至2009年12月在山东大学附属省立医院胸外科接受手术治疗的196例pN0期食管鳞癌患者为研究对象。通过免疫组化技术检测上述患者癌组织中CEP55的表达情况,并对患者进行随访。相关资料建立数据库通过SPSS 17.0软件进行分析,应用Kaplan-Meier法计算患者生存率,患者间生存率差异用Log-rank检验加以比较,分析生存率的预后因素应用Cox多因素回归加以判断。当P值<0.05时,认为有统计学意义。结果：通过Kaplan-Meier生存曲线可以看出,本实验中ESCC患者总体的1年、3年、5年生存率分别是96.4%,62.8%和35.2%。中位生存时间是48.0个月(95%可信区间：38.6-57.4个月)。ESCC组织中未查到CEP55高表达的患者,其1年、3年、5年生存率分别是97.2%,81.9%和47.2%；而ESCC组织中有CEP55表达的患者,其1年、3年、5年生存率分别是96.0%,51.6%和27.4%,中位生存时间为37.0个月(95%可信区间：31.9-42.1个月)。单因素分析表明CEP55表达水平是ESCC患者重要的预后因素(P=0.001)。ESCC组织中无CEP55高表达的患者5年生存率显著高于ESCC组织中有CEP55高表达的患者。同时单因素分析显示肿瘤大小,T分期,分化程度及TNM分期等也是重要的预后因素。T分期不同,患者5年生存率显著不同：pTl组92.3%、pT2组64.3%、pT3组3%(P<0.01)。分化类型为高、中分化ESCC患者5年生存率为53.5%,而低分化的ESCC患者5年生存率为10.4%,Log-Rank检验显示总体间差别有统计学意义(P<0.01)。pTNM分期不同组别间5年生存率差别有统计学意义,分别为：pⅠ组92.3%,pⅡA组65.5%,pⅡB组0%(P<0.01)。此外,分析结果显示,pN0期ESCC患者的5年生存率与患者性别(Gender)、年龄大小(Age)等无显著相关性。多因素回归分析显示,T分期(P=0.001),TNM分期(P=0.000),肿瘤分化程度(P=0.031)和CEP55表达水平(P=0.008)均是pN0期ESCC患者预后的独立危险因素。结论：与pN0期ESCC患者术后5年生存率显著相关的因素有肿瘤大小,T分期,肿瘤分化程度,TNM分期及CEP55表达水平。CEP55表达水平是pN0期ESCC患者术后5年生存率的独立危险因素。第三部分CEP55 siRNA体外阻断CEP55表达对食管鳞癌Eca109细胞生物学行为影响的研究目的：探讨CEP55 siRNA体外阻断CEP55表达前后食管鳞癌Eca109细胞的生物学行为的差异。方法：应用RT-PCR和Western blot分别从mRNA和蛋白水平检测食管鳞癌细胞系中CEP55的表达情况。通过慢病毒携带CEP55 siRNA转染CEP55表达水平最高的食管鳞癌Eca109细胞系,抑制CEP55的表达,构建稳定的经RT-PCR和Western blot检验抑制CEP55表达的Eca109细胞系。应用MTT法比较抑制CEP55表达前后Eca109细胞的增殖情况。通过Transwell侵袭实验比较抑制CEP55表达前后Eca109细胞的侵袭能力。结果：食管鳞癌细胞系中存在CEP55高表达。本实验中我们应用慢病毒携带CEP55 siRNA转染食管鳞癌细胞系,成功构建了经RT-PCR和Western blot检测CEP55稳定低表达的Eca109细胞系。实验结果显示抑制CEP55的表达能够体外抑制食管鳞癌细胞的增殖和侵袭能力。结论：CEP55与食管鳞癌细胞的增殖及侵袭能力相关。