一株高效产絮菌的基因组测序及胞外多糖合成组学研究

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微生物絮凝剂(Microbial flocculant,MBF)是由微生物产生并分泌到细胞外的聚合物,一般由多糖、蛋白质、核酸等高分子物质构成。由于具有安全高效的特性,微生物絮凝剂已成为国内外广泛使用的水处理剂,但生产成本较高和絮凝效果不稳定等问题,限制了微生物絮凝剂的应用。本研究通过多种检测技术对高效产絮菌A9的生物学和基因组特性,及其在不同碳源培养条件下的转录组和蛋白质组的表达差异等进行了检测分析,从分子水平研究产絮菌的产絮机理,从转录组及蛋白质组学角度研究产絮菌产絮过程差异表达基因、蛋白质及功能调控,为工业化生产微生物絮凝剂提供调控方法。研究结果对揭示产絮菌合成絮凝剂的机制和调控途径,为进一步利用代谢工程等提高微生物絮凝剂的产量,促进微生物絮凝剂资源的开发和利用等提供数据支持和理论依据。
  应用多种检测技术对产絮菌A9的生理生化、细胞化学组分和16SrRNA基因序列等进行了检测,研究其生物学特性及分类,并对分离提纯的发酵产物进行紫外和红外分析。基于生理生化、细胞化学组分及16SrRNA基因序列等分析结果,产絮菌A9被鉴定为类芽孢杆菌属内的新种。紫外扫描和红外检测等结果表明,产絮菌A9所产絮凝剂的主要成分为多糖类物质,并且吸附架桥是其产生絮凝作用的主要机理。对产絮菌A9生物学特性和絮凝成分的研究,有助于系统的了解产絮菌A9的表型、遗传型、系统发育及其所产絮凝剂的性质,为后续研究产絮菌A9的基因组及絮凝剂合成途径等奠定基础。
  采用Illumina测序技术对产絮菌A9的DNA进行paired-end测序,研究产絮菌A9基因组、胞外多糖合成相关的功能基因及其代谢途径,并使用分子生物学技术,进行了产絮菌A9胞外多糖合成相关基因的克隆和异源表达。获得产絮菌A9的基因组序列由92个contigs组成,可以组装到67个scaffolds中。应用Glimmer软件成功预测4932个基因,其中有4284个(86.9%)与NCBI-Nr数据库比对到相似序列,共有1,689个蛋白注释到COG家族。通过blastp基于KEGG数据库的功能注释与代谢路径分析,预测了165条代谢通路,包含糖酵解途径、三羧酸循环、戊糖磷酸途径等产能代谢途径。根据基因组测序分析结果,解析了产絮菌A9在以葡萄糖为碳源时的胞外多糖合成途径,产絮菌A9胞外多糖包含葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、N-乙酰氨基葡萄糖和甘露糖,结果和此前的研究结论一致。参与胞外多糖合成的相关酶包括磷酸葡萄糖变位酶、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶、UDP-葡萄糖脱氢酶等。产絮菌A9的全基因组扫描测序为了解其基因组信息和代谢通路,研究其所产絮凝剂胞外多糖的合成途径和功能基因等提供数据支持。产絮菌A9胞外多糖合成相关基因的克隆和异源表达,为研究产絮菌胞外多糖合成基因的特性和功能,以及后续利用其胞外多糖合成基因构建高效微生物絮凝剂工程菌等提供借鉴。
  利用RNA-Seq技术进行菌株A9转录组测序,研究产絮菌A9在不同碳源培养条件下的转录表达差异。基因表达差异(发酵vs普通)分析表明,表达差异显著的基因有70个。通过转录组分析表明:相对于普通培养基,在葡萄糖培养基的培养条件下,很多糖类合成及代谢的基因都上调表达。产絮菌A9在不同碳源培养条件下的转录组测序及差异表达基因分析,为从RNA水平研究产絮菌的产絮机理,及其合成微生物絮凝剂胞外多糖的代谢调控等提供数据支持。
  通过蛋白质双向电泳和质谱鉴定技术,对产絮菌A9在普通培养基、葡萄糖培养基和甘露糖培养基培养条件下的蛋白质组进行了分离和检测,研究产絮菌A9在不同碳源培养条件下蛋白质组表达差异。胶图分析结果表明:产絮菌A9在不同碳源培养条件下蛋白质表达有较大差异。通过质谱分析,共有个54蛋白被成功鉴定,包括二氢硫辛酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、果糖-1,6-二磷酸酶等。这些差异蛋白的功能主要与能量产生和转化,以及碳水化合物的转运和代谢等有关。产絮菌A9在不同碳源培养条件下差异表达蛋白的鉴定分析,为从蛋白质水平研究产絮菌的产絮机理,全面解析和调控产絮菌代谢途径,具有重要的指导意义。在产絮菌A9转录组和蛋白质组检测分析的基础上,通过培养实验,进行产絮菌A9生产微生物絮凝剂胞外多糖的调控研究。建立起培养条件,差异表达基因及蛋白质和产絮变化之间的关系,对工业上生产微生物絮凝剂提出了菌种复壮、底物水平调控、发酵过程参数优化三个层面的调控策略。
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