【摘 要】
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磷脂酶D（EC 3.1.4.4）是用于磷脂改性的重要工具酶之一,在食品、医药、日化等行业有着广泛的应用前景,开展磷脂酶D的挖掘及酶学特性研究具有重要意义。本课题组前期通过基因挖掘获得一种海洋Moritella sp.JT01磷脂酶D（Ms PLD）,对其进行了原核重组表达和酶学性质研究,并发现其在催化合成磷脂酸方面具有应用潜力。本研究在前期工作的基础上,尝试对Ms PLD的三维结构进行解析,进一步
【基金项目】
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国家自然科学基金（编号:31972014）；
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磷脂酶D（EC 3.1.4.4）是用于磷脂改性的重要工具酶之一,在食品、医药、日化等行业有着广泛的应用前景,开展磷脂酶D的挖掘及酶学特性研究具有重要意义。本课题组前期通过基因挖掘获得一种海洋Moritella sp.JT01磷脂酶D（Ms PLD）,对其进行了原核重组表达和酶学性质研究,并发现其在催化合成磷脂酸方面具有应用潜力。本研究在前期工作的基础上,尝试对Ms PLD的三维结构进行解析,进一步基于结构和生物计算开展突变体理性设计并对各突变体的生化特性进行表征。相关研究为深入理解该酶的结构功能关系以及指导该酶的应用提供重要参考。具体开展的研究内容与获得的结果如下:（1）Ms PLD晶体结构解析在20%PEG1000,0.1 M磷酸氢二钠/柠檬酸p H 4.2,0.2 M硫酸锂的条件下获得了高质量的蛋白晶体,通过X射线衍射解析获得了分辨率为2.3（?）的Ms PLD晶体结构（PDB ID:7WU1）。Ms PLD的一个晶胞中含有六个蛋白分子,每个分子的结构基本一致,以对称规则的环形排列在晶胞中,每个蛋白分子整体呈现β-α-β-α-β的“三明治结构”,由12个α螺旋和21个β折叠片组成。蛋白一级序列中具有两个高度保守的HKD基序。将Ms PLD与链霉菌来源的PMF PLD（PDB ID:1F0I）和Sa PLD（PDB ID:2ZE4）进行对比,发现虽然其在一级序列上一致性较低（分别为21.83%和22.09%,低于30%）,但它们催化活性中心的保守氨基酸HKD在空间排布上高度重合。（2）基于结构和分子动力学模拟计算改造提升Ms PLD的热稳定性基于Ms PLD的晶体结构,通过分子动力学模拟获得该酶结构中的不稳定区域信息,进而采用在不稳定区域引入二硫键的策略来提高酶蛋白稳定性。以野生型质粒p ET-21a（+）-Ms PLD为模板,通过定点突变的方式引入半胱氨酸,最终获得15株突变体。筛选出Tm和半衰期较野生型有显著提升的突变体S148C-T206C和D225C-A328C,在此基础上将两对二硫键进行叠加突变,得到了突变体S148C-T206C/D225C-A328C。以大豆磷脂酰胆碱为底物,对叠加突变体在最适反应条件下的动力学参数进行测定,结果表明其kcat/KM值是野生型的1.36倍,半衰期为野生型的3.15倍,在不影响该酶活力的同时极大的提高了Ms PLD的热稳定性;在催化合成磷脂酸的应用方面,S148C-T206C/D225C-A328C达到反应平衡的时间为2 h（转化率同样为86.0%）,相较于野生型的6 h,反应时间缩短到原来的1/3。（3）Ms PLD结构中特殊Loop区对酶蛋白生化特性的影响研究将Ms PLD的结构与链霉菌来源的PLD（PMF PLD,Sa PLD）结构进行叠合,发现Ms PLD有一段特殊的Loop区域。为探究该Loop区是否会对Ms PLD酶蛋白生化特性产生影响,分别采用截短、替换和引入二硫键三种策略设计突变体。结果表明,截短突变体Del57-113和Del65-113及替换突变体Ms PLD-1F0I都检测不到对大豆磷脂酰胆碱的水解活力,说明特殊Loop区的完整性对于保持Ms PLD的酶活力非常重要。突变体N61C-R284C、E75C-A156C、K102C-S163C的酶活力都低于野生型,说明特殊Loop区柔性的下降也会造成Ms PLD的酶活力降低。基于磷脂酶作为界面酶的催化反应基本理论,进一步从酶蛋白界面吸附角度考察了该Loop区对于酶蛋白界面吸附特性的影响。发现Del57-113、Del65-113及Ms PLD-1F0I对大豆磷脂酰胆碱单分子层膜的结合能力（用协同因子a表示）由原来的0.35降低到0.22、0.10和0.29,最大插入压力MIP由野生型的31.52 m N/m分别降至23.86、27.40和28.43 m N/m（p＜0.05）。基于上述结果,我们提出了特殊Loop区对Ms PLD蛋白界面吸附的作用模型,推测特殊Loop区在酶蛋白与底物结合的过程中起到界面锚定作用,帮助酶蛋白结合到磷脂膜上,进而发生催化反应。
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