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目的在哮喘病理生理过程中,气道平滑肌细胞(ASMC)的表型转换是引起气道重塑的重要机制。我们前期研究发现HMGB1参与支气管哮喘气道重塑过程,在小鼠哮喘动物模型上,拮抗HMGB1活性后降低了小鼠气道ASM厚度,但其机制仍未完全了解。本研究初步探讨HMGB1对大鼠气道平滑肌细胞表型转换的影响及相关机制。方法采用原代培养技术培养SD大鼠气道平滑肌细胞(ASMC)。ASMC用含10%FBS的DMEM培养24小时,换用无血清的DMEM继续培养24小时,使细胞生长同步。1ASMC分为4组:1对照组:仅用2%血清DMEM处理ASMC;2HMGB1 100ng/ml组:用HMGB1 100ng/ml2%血清DMEM处理ASMC;3HMGB1 500ng/ml组:用HMGB1 500ng/ml2%血清DMEM处理ASMC;4HMGB1 1000ng/ml组:用HMGB11000ng/ml 2%血清DMEM处理ASMC。各组种在六孔板培养24h后。干预结束,用0.25%胰蛋白酶消化后收集细胞用于检测后续各项指标。2采用划痕实验、transwell检测HMGB1对ASMC的迁移能力的影响。免疫荧光观察不同浓度HMGB1对ASMC骨架重排的影响。流式细胞术检测不同浓度HMGB1 ASMC的细胞周期分布影响。Western blot(WB)检测不同浓度HMGB1 ASM细胞PCNA、α-smooth muscle actin(α-actin)和SM-22α蛋白表达的影响。3分组:对照组,HMGB11000ng/ml组,HMGB1+抗RAGE组,HMGB1+抗TLR2组、HMGB1+抗TLR4组,收集各组标本后分别WB检测ASMCα-actin和SM-22α表达;免疫荧光观察各组ASMC骨架重排变化。(4)分组:对照组,HMGB11000ng/ml组,HMGB1+LY29400组和LY29400组,收集各组标本后WB检测ASMC的α-actin和SM-22α的表达。免疫荧光观察各组ASMC骨架重排变化。(5)分组:对照组,HMGB1 1000ng/ml组,HMGB1+抗RAGE组和HMGB1+LY29400组,WB检测各组ASMC AKT磷酸化水平。结果1、HMGB1能增强划痕实验、transwell中ASMC的迁移能力,随着HMGB1浓度升高,对ASMC的迁移能力的影响也越强。在荧光显徽镜下观察到:HMGB1可刺激ASMC骨架重排,肌丝增多,细胞多呈板状,呈现出较强张力状态;随着HMGB1浓度升高,作用越强。应用LY294002、抗RAGE受体后,可减弱HMBG1的作用,使肌丝减少。2、流式细胞术结果显示:HMGB1 500ng/ml组、HMGB1 1000ng/ml组的ASMC跃出Gl期,进入G2期、S期的细胞比例明显增加,与对照组、HMGB1 100ng/ml组相比较,G2期、S期的细胞比例的差异均有统计学意义(P<0.05)。对照组与HMGB1 100ng/ml组相比较,G2期、S期的细胞比例的差异无统计学意义(P>0.05)。3、HMGB1诱导ASMC的PCNA蛋白表达显著增加(P<0.05),且随着浓度的增加蛋白表达增加明显。4、HMGB1诱导ASMC SMA-22α和α-SMA蛋白表达显著减少(P<0.05),且随着浓度的增加蛋白表达减少更明显。5、与HMGB1 1000ng/ml组比较,HMGB1+抗RAGE组ASMC的α-actin和SM-22α表达上调,差异有统计学意义(P<0.05);与HMGB11000ng/ml组比较,HMGB1+抗TLR2组和HMGB1+抗TLR4组ASMC的α-actin和SM-22α表达无统计学差异(P>0.05)。6、与HMGB1 1000ng/ml组比较,HMGB1 1000ng/ml+LY294002组的ASMC的α-actin和SM-22α表达上调,差异有统计学意义(P<0.05);7、与对照组比较,HMGB11000ng/ml组的AKT磷酸化水平明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05);与HMGB1 1000ng/ml组比较,HMGB1+LY294002组和HMGB1+抗RAGE组ASMC的AKT磷酸化水平降低(P<0.05)。结论HMGB1显著增加ASMC的增殖、迁移能力,促使ASMC骨架重排,调节ASMC表型标志物的表达,从而HMGB1诱导了ASMC表型转换。HMGB1可能通过RAGE、PI3K信号通路诱导ASMC表型转换。以上研究内容有助于对ASM重塑的新机制尤其气道平滑肌表型转换提供新的见解,并有助于为哮喘的气道重塑提供新的治疗靶点。第一部分:SD大鼠气道平滑肌细胞原代培养和鉴定目的建立SD大鼠气道平滑肌细胞(ASMC)原代培养方法并鉴定,为相关研究提供试验材料。方法6-8周龄雄性健康SD大鼠,重量200-250g,10%水合氯醛腹腔内注射麻醉,消毒并切开皮肤,分离皮下组织获取气管,经过酶消化法获取细胞。结果通过形态学及间接免疫荧光检测培养细胞α-smooth muscle actin(α-actin)表达,对培养细胞进行鉴定。结论采用酶消化法可以获取较高纯度的气管平滑肌细胞。第二部分:HMGB1调节气道平滑肌细胞表型转换的研究目的研究不同浓度HMGB1(0ng/ml,100ng/ml,500ng/ml,1000ng/ml)对大鼠气道平滑肌细胞表型转换的影响。方法:将原代ASMC分为4组:1对照组:仅用2%血清DMEM处理ASMC;2HMGB1 100ng/ml组:用HMGB1 100ng/ml 2%血清DMEM处理ASMC;3HMGB1 500ng/ml组:用HMGB1 500ng/ml 2%血清DMEM处理ASMC;4HMGB1 1000ng/ml组:用HMGB1 1000ng/ml 2%血清DMEM处理ASMC。各组ASMC种在六孔板培养24h后。干预结束,用0.25%胰蛋白酶消化后收集细胞用于检测后续各项指标。划痕实验、transwell检测HMGB1对ASMC的迁移能力的影响。TRITC标记鬼笔环肽染色ASM细胞,免疫荧光显微镜观察不同浓度HMGB1对ASMC轮廓及肌丝变化的影响。PI单染流式细胞术检测不同浓度HMGB1对ASMC的细胞周期分布影响。WB检测不同浓度HMGB1对ASMC PCNA、α-actin和SM-22α蛋白表达的影响。结果:1、在划痕实验中,HMGB1能增强ASMC迁移能力,随着HMGB1浓度升高,对ASMC的迁移能力也越强。对照组、HMGB1 100ng/ml组、HMGB1500ng/ml组和HMGB1 1000ng/ml组细胞修复面积分别为:34.54±2.62%、48.32±3.15%、74.23±3.43%、83.65±4.21%。划痕实验结果显示:HMGB1100ng/ml组、HMGB1 500ng/ml组和HMGB1 1000ng/ml组细胞修复面积较对照组增加(P<0.05),且HMGB1500ng/ml组和HMGB1 1000ng/ml组细胞修复面积较HMGB1 100ng/ml组、对照组增加,呈剂量依赖性(P<0.01)。2、Transwell实验中,对照组、HMGB1 100ng/ml组、HMGB1500ng/ml组以及HMGB1 1000ng/ml组ASMC迁移的细胞数分别为8.92±0.13(个)、12.3±0.57(个)、18.3±0.28(个)、24.5±0.23(个),HMGB1 100ng/ml组、HMGB1 500ng/ml组以及HMGB11000ng/ml组迁移的ASM细胞数较对照组增加(P<0.05),HMGB1500ng/ml组以及HMGB1 1000ng/ml组迁移的ASM细胞数较对照组、HMGB1 100ng/ml组明显增加,呈剂量依赖性(P<0.01)。HMGB1能促进ASM细胞迁移,且随着浓度的增加迁移能力也增强。3、TRITC标记鬼笔环肽染色检测ASM细胞轮廓及肌丝变化,荧光显微镜下观察,HMGB1可刺激ASMC骨架重排,肌丝增多,细胞多呈板状,呈现出较强张力状态。随着HMGB1浓度升高,作用越强。4、PI单染的流式细胞术检测不同浓度HMGB1作用后大鼠气道平滑肌细胞的周期分布结果显示:对照组、HMGB1 100ng/ml组、HMGB1500ng/ml组和HMGB1 1000ng/ml组细胞G0/G1期细胞百分比分别为:83.83±2.62、79.31±1.35、73.24±2.23、65.37±1.81;S期细胞百分比分别为5.62±0.31、7.19±0.52、14.93±1.27、15.92±1.33;G2期细胞百分比分别为:8.14±0.45、9.37±0.63、13.36±0.95、19.91±1.54;HMGB1 500ng/ml组、HMGB1 1000ng/ml组跃出Gl期,进入G2期、S期的细胞比例明显增加,与对照组、HMGB1 100ng/ml组相比较,G2期、S期的细胞比例的差异均有统计学意义(P<0.05)。对照组与HMGB1 100ng/ml组相比较,G2期、S期的细胞比例的差异无统计学意义(P>O.05)。5、与对照组比较,HMGB1 100ng/ml组、HMGB1 500ng/ml组以及HMGB1 1000ng/ml组ASMC SMA-22α和α-SMA蛋白表达显著减少(P<0.05)。6、与对照组比较,HMGB1 100ng/ml组、HMGB1 500ng/ml组以及HMGB1 1000ng/ml组ASMC PCNA蛋白表达增加(P<0.05);且HMGB1导致ASMC PCNA蛋白表达增加呈浓度依赖性。结论:HMGB1促进ASMC的增殖和迁移,HMGB1可诱导ASMC骨架重排,肌丝增多,HMGB1诱导ASMC表型标志物SMA-22α和α-SMA蛋白表达显著减少,表明HMGB1诱导ASMC表型转换。第三部分HMGB1调节气道平滑肌细胞表型转换的相关机制目的初步探讨HMGB1通过何种受体(RAGE、TLR2、TLR4受体)参与调节ASMC表型转换,HMGB1是否通过PI3K通路参与调节ASMC表型转换。方法:1、分组:对照组,HMGB1 1000ng/ml组,HMGB1+抗RAGE组,HMGB1+抗TLR2组、HMGB1+抗TLR4组,收集各组标本后分别WB检测ASMCα-actin和SM-22α表达;免疫荧光观察各组ASMC骨架重排变化。2、分组:对照组,HMGB1 1000ng/ml组,HMGB1+LY29400组和LY29400组,收集各组标本后WB检测ASMC的α-actin和SM-22α的表达。免疫荧光观察各组ASMC骨架重排变化。3、分组:对照组,HMGB1 1000ng/ml组,HMGB1+抗RAGE组和HMGB1+LY29400组,WB检测各组ASMC AKT磷酸化水平。结果:1、与HMGB1 1000ng/ml组比较,HMGB1+抗RAGE组ASMC的α-actin和SM-22α表达上调,差异有统计学意义(P<0.05);与HMGB1 1000ng/ml组比较,HMGB1+抗TLR2组和HMGB1+抗TLR4组ASMC的α-actin和SM-22α表达无统计学差异(P>0.05)。2、与HMGB1 1000ng/ml组比较,HMGB1 1000ng/ml+LY294002组的ASMC的α-actin和SM-22α表达上调,差异有统计学意义(P<0.05);3、与对照组比较,HMGB1 1000ng/ml组的AKT磷酸化水平明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05);与HMGB1 1000ng/ml组比较,HMGB1+LY294002组和HMGB1+抗RAGE组ASMC的AKT磷酸化水平降低(P<0.05)。结论:HMGB1可能通过RAGE受体、PI3K通路参与调节ASMC表型转换,以上研究内容对ASMC重塑的机制提供新的见解,并有助于为哮喘的气道重塑提供潜在的新治疗靶点。