目的::目前我国艾滋病疫情已经从历史上的静脉吸毒人群、有偿采供血人群为主,转变为近年来以性传播为主,其中男男性接触人群(Men Who Have Sex With Men,MSM)的HIV疫情快速增长。根据中国艾滋病性病疫情估计报告,新诊断HIV感染者中MSM所占比例已经增加数十倍。在我国,由于传统婚育道德观和社会歧视因素等影响,大部分MSM人群选择与异性结婚,成为向普通女性传播的“桥梁人群”,影响人群更广,干预难度更大,我们急需新技术指导,科学地开展HIV预防干预。同时我国“四免一关怀”政策的实施以及开始抗病毒治疗的时机不断提前、各级疾控部门及研究机构开展的大量艾滋病干预研究及干预工作,如何更有效地开展治疗和干预,提高控制HIV传播的效果,需要新的科学手段做指导,治疗及干预措施效果如何,目前还主要依赖于新诊断感染者例数来判断,还需要更多的科学评估方法。由于HIV本身的高度特异性,同时受到宿主免疫反应及抗病毒治疗药物的选择压力等因素影响,每个感染者携带的HIV毒株序列都具有指纹特质,故HIV序列可以识别密切相关的病毒株的感染者。利用HIV序列构建分子传播网络,鉴定传播簇的方法在识别其他方法无法发现的传播簇方面尤为有用。分子传播网络目前主要用于以下几方面:①提示地区和人群间的病毒传播联系;②揭示传播网络中的最关键人群;③揭示传播网络中感染者的人口学、行为学及生物学特征,明确驱动病毒传播相关因素;④指导开展靶向干预;⑤评估干预措施效果;⑥预测疫情发展趋势。以往国外的病毒分子网络研究主要针对B亚型毒株,疫情相对平稳的情况下进行,在多种HIV毒株共同流行,且传播动力学不同的复杂情况下,如何运用病毒分子传播网络评估干预效果及指导靶向干预仍待研究。沈阳是辽宁省省会,是我国最早报告MSM人群HIV疫情的地区,估计男同人数14万人,仅次于北京市。本团队早期的研究发现1991-2007年辽沈地区异性传播人群多亚型病毒共存,其他传播途径人群有各自的优势流行株,男同快速增长,血液传播迅速减少,CRF0I_AE取代B亚型成为优势株。我们的后续研究发现沈阳市MSM人群HIV基因型复杂,主要存在CRF01_AE、CRF07_BC及B亚型三种基因型以及多种重组型病毒。近期,本团队与美国加州大学合作,对本地HIV感染者进行了分子网络的初步分析,并建立了针对本地多种传播动力学不同的HIV流行株共同流行的优化的基因距离阈值。本研究在此基础上,本研究采用优化参数的分子传播网络方法,进行大样本回顾性研究,揭示HIV传播簇扩张及新生的动态变化,并以分子传播网络动态变化情况回顾性评价近年来沈阳市HIV预防干预及治疗对控制-mV传播的效果,并进一步明确在此条件下仍在发生的HIv传播相关的人口学、流行病学及生物学因素,为在HIV疫情复杂的局部地区开展以分子传播网络为基础的HIV防治措施控制HIV疫情的效果评估及通过有效识别更高危人群特征实时精准干预提供科学依据。研究方法:1、研究对象:2002-2016年间,于中国医科大学附属第一医院就诊的来自沈阳市的2268例HIV-1感染者和2132名有高危行为的HIV阴性志愿MSM人员。收集HIV-1阳性者血浆样本,同时收集感染者和高危人群的人口学(性别,年龄,民族,职业,教育情况,婚姻状况等)、地理学(户籍地等)及临床和生物学数据(病毒载量等)信息,形成数据库。所有感染者和高危人群均签署知情同意书,本研究经过中国医科大学附属第一医院伦理委员会批准。2、血浆标本HIVRNA提取和pol区扩增:收集HIV感染者全血并分离血浆,采用QIAamp RNAMini Kit试剂盒,按照说明书标准protocol从140μl感染者血浆中快速提取出60μl HIV病毒RNA,利用巢式PCR方法分两轮进行HIV-Ipol 1.0Kb部分基因片段(HXB2:2352-3352)扩增。第一轮扩增引物为MAW-26:5’-TTGGAAATGTGGAAAGGAAGGAC-3’和 RT-21:5’-CTGTATTTCTGCTATTAAGTCTTTTGATGGG-3’,第二轮扩增引物为PRO-1:5’-CAGAGCCAACAGCCCCACCA-3’和 RT-4R:5’-CTTCTGTATATCATTGAC AGTCCAGCT-3’。3、序列质量评估:利用在线序列校对软件HIV Align对序列进行自动比对后手工校正,保留长度为1000bp(HXB2:2253-3252),覆盖蛋白酶区1～99氨基酸和逆转录酶区1～234氨基酸。4、感染者病毒序列亚型鉴定:利用FastTree3.0构建以N亚型为外群的近似最大似然树(appproximately-maximum likelihood phylogenetic tree,ML Tree),核苷酸替代模型为GTR+G+I,利用软件内嵌的SH检验(ShimodairaHasegawa-like test)计算进化树节点(分支点)值。根据ML Tree结果将2002-2016年所有HIV感染者病毒序列按亚型分为单独的Fasta格式文件。5、传播网络可视化:利用HYPHY 2.2.4TN93模型计算pol基因序列间的成对距离并导出。筛选小于网络构建阈值的基因距离数据导入Gephi(CRF01_AE选取基因距离<0.006的数据,CRF07_BC选取基因距离<0.006的数据,B亚型选取基因距离<0.016的数据),实现HIV分子传播网络可视化。根据分析需求赋予节点不同属性(大小,颜色,形状等)。6、基于传播网络的相关分析:以年为单位进行分子传播网络的动态分析。计算各年份沈阳地区HIV分子传播网络播簇人群构成比例、各年份沈阳地区HIV分子传播网络传播簇成簇率。按照沈阳地区HIV分子传播网络传播簇大小和扩散速度进将传播簇行分类,明确沈阳HIV感染者不同规模/扩散速度的传播簇和静止/扩张/新生传播簇对疫情的贡献。以网络为基准观察近年来沈阳地区在ART和其他干预措施条件下,不同类型传播簇的动态变化,分析沈阳地区整体HIV预防、治疗干预的效果。同时选择分子传播网络中一个大型传播簇,从大型传播簇的扩张变迁解析ART为主的干预措施对降低HIV传播效果。7、统计学方法:使用SPSS 20.0统计软件包对数据库进行整理和分析。2002-2016年间网络中全部成簇病例、大型/快速传播簇病例及非成簇病例中剔除2009年以前和非MSM的个体后,分别与2009-2016年间MSM高危人员进行比较,应用Logistic回归模型分析两组感染者间的差异。单因素Logistic 回归分析P值小于0.05的变量全部纳入多因素模型,P值小于0.05表示差异有统计学意义。结果:1、沈阳地区HIV感染者分子传播网络的构成特点1.1沈阳主要流行CRF01_AE、CRF07_BC、B亚型3种毒株研究期内,于中国医科大学附属第一医院就诊的HIV感染者共2268名,利用血浆HIV病毒pol基因序列构建的ML Tree显示,CRF01_AE亚型的感染者最多,占75.8%,CRF07_BC亚型感染者和B亚型感染者相对CRF01_AE亚型感染者较少,分别为12.2%和7.8%,其它亚型仅占4.1%。1.2三种主要亚型HIV分子传播网络的总体构成三种主要亚型网络中,MSM在CRF01_AE亚型CRF07_BC和B亚型网络中所占比例分别为88.2%,91.4%及77.8%;异性性传播者(Heterosexual,HTS)人群在B亚型网络传播簇中所占比例达到21.4%;静脉吸毒者(Intravenous Drug Users,IDU)人群在三种亚型分子传播网络中均低于1.5%。3种亚型分子传播网络中,均可见MSM与HTS人群相互交叉连接。IDU人群在CRF01_AE亚型网络中基本单独成簇,偶有与MSM人群的连接,而在CRF07_BC和B亚型网络中,IDU均可见与HTS人群交叉连接。1.3三种主要亚型分子传播簇人群构成均以MSM为主2002-2016年间,三种主要亚型网络传播簇的构成人群逐渐从HTS居多向MSM为主过渡,IDU人群较少。B亚型网络中虽然MSM和HTS人群比例波动不定。但值得注意的是,2008年以后,三种主要亚型分子传播簇的均主要由MSM人群组成,且MSM人群所占比例明显高于HTS人群。1.4三种主要亚型HIV分子传播网络均存在大型传播簇三种主要病毒亚型分子传播网络中由2个个体构成的传播簇数量最多,且均存在≥10个个体的大型传播簇,CRF01_AE、CRF07_BC和B亚型网络中,大型传播簇的个数分别为7个、1个和2个。2、沈阳地区HIV感染者分子传播簇的动态变化2.1三种主要亚型HIV分子传播网络的动态变化为了揭示沈阳地区HIV分子传播网络的变迁情况,我们以年为单位,动态分析三种亚型分子传播网络中传播簇的扩张情况,发现三种亚型毒株中,均存在原有传播簇基础上扩张及出现新生传播簇的情况,也有一些原有传播簇不再或很少扩张,而呈现静止状态的情况。2.2三种主要亚型HIV分子传播网络传播簇的成簇率变迁情况我们重点分析2008年以来,MSM人群在沈阳HIV疫情中占主导作用的时期,不同亚型传播簇的动态变化,发现2008-2010年,CRF07_BC和B亚型网络传播簇成簇率明显高于CRF01_AE亚型网络传播簇,自2011年开始,CRF01_AE和CRF07_BC亚型网络传播簇成簇率明显下降,成簇率18.0%～40.9%以下,而B亚型网络传播簇成簇率显著上升,成簇率66.7%～77.8%。2.3大型/快速传播簇对疫情影响逐渐减弱根据传播簇规模和增长速度,将大型/快速传播簇定义为2016年时≥10个节点和/或2009-2016年节点增长速度≥3个/年的传播簇;而中小型/缓慢传播簇则为不满足大型/快速扩张传播簇条件的节点数≥2的传播簇。结果发现随年份变化,新诊断感染者的总体成簇率逐渐下降,大型/快速传播簇影响力逐步下降,中小型/缓慢增长传播簇影响力增加。2.4不同类型传播簇对沈阳地区HIV疫情增长的驱动作用正在逐步发生变化为进一步分析不同年份中,主要驱动作用HIV疫情增长的传播簇,我们根据传播簇的变化特点定义了扩张簇、静止簇及新生簇。扩张簇为下一年有新增感染者的传播簇,静止簇为下一年没有新增感染者的传播簇,新生簇定义为下一年出现的与之前无连接的新传播簇。结果发现随年份变化,已有传播簇扩张在年度新增感染者中所占比例对疫情影响减小,从2009年的36%下降到2016年的20%,新生簇的变化不显著,而簇外病例从2009年的45%提高到2016年的65%。3、以分子传播网络为基础的沈阳地区HIV治疗及预防干预效果的回顾性评价3.1不同时期ART为主的干预措施对HIV传播的控制作用随着ART覆盖率的扩大,分子传播网络中,由于转介等病例来源渠道因年而异,各年份监测到的新增感染者中数量波动,尤其是2014年以来大幅增加,但值得注意的是,其中近期感染者数并未增长,且有下降趋势;且新增感染者中,属于大型/快速传播簇的病例所占比例不断缩小,从2009年的39%下降到2016年的14%,中小型/缓慢传播簇从2009年的16%上升到2016年的21%,提示大型快速传播簇对疫情的影响在缩小;另一方面,分子网络中病例的病毒控制率显著增加;已有传播簇扩张及新生簇在传播簇中所占比例均下降,而静止簇比例增加。上述现象均提示,近年来的积极预防干预工作,对病毒分子传播网络产生明显影响。3.2从大型传播簇的扩张变迁解析近年来治疗干预措施对控制HIV传播的作用为了进一步明确近年来的预防干预效果,我们选择了一个CRF01_AE大型/快速传播簇AECL2进行独立观察分析:随着ART覆盖率的扩大,传播簇中病毒控制者比例不断提高,虽然因外单位转介治疗病例的加入,新增病例数2013-2015年出现一过性上升,2016年又显著回落,新增感染病例中,仅在2009年检出3例近期感染者。4、在积极预防治疗干预下,驱动沈阳地区HIV传播的相关因素分析4.1 2008-2016沈阳HIV成簇传播的相关危险因素分析为了明确沈阳市HIV成簇传播的相关因素,我们运用logistic回归进行分析,将三种不同亚型网络中成簇人群分别与高危人群进行比较。CRF01_AE网络中以研究对象是否在CRF01_AE网络传播簇中作为结局变量,在多因素logistic回归分析中,文化程度、婚姻状况、职业、年龄、户籍地变量间相互校正后,我们发现已婚(VS.未婚)(AOR=1.76,95%CI=1.20-2.58,P=0.004),离异(VS.未婚)(AOR=1.88,95%CI=1.13-3.14,P=0.016);年龄在 25-29 岁之间(VS.≤24)(AOR=1.54,95%CI=1.10-2.15,P=0.011),年龄在 30-39 岁之间(VS.≤24)(AOR=1.99,95%CI=1.38-2.87,P<0.001),年龄在 40-49 岁之间(VS.≤24)(AOR=2.10,95%CI=1.30-3.39,P=0.003),年龄≥50(VS.≤24)(AOR=2.13,95%CI=1.19-3.84,P=0.012);户籍地为沈阳(VS.非沈阳)(AOR=11.32,95%CI=8.44-15.18,P<0.001)为CRF01_AE亚型MSM感染者成簇传播的独立危险因素。CRF07_BC网络中以研究对象是否在CRF07_BC网络传播簇中作为结局变量,在多因素logistic回归分析中,文化程度,职业、年龄、户籍地变量间相互校正后,我们未发现CRF07_BC亚型MSM感染者成簇传播的独立危险因素。B亚型网络中以研究对象是否在B亚型网络传播簇中作为结局变量,在多因素logistic回归分析中,文化程度、职业、户籍地变量间相互校正后,我们发现职业为农民(VS.其他)(AOR=9.51,95%CI=1.49-60.74,P=0.017);户籍地为沈阳(VS.非沈阳)(AOR=29.11,95%CI=10.36-81.79,P<0.001)为 B 亚型 MSM 感染者成簇传播的独立危险因素。4.2 2008-2016沈阳大型/快速传播簇的相关危险因素分析为了进一步区分沈阳大型/快速传播簇的相关危险因素,我们运用logistic回归进行分析,将三种不同亚型网络中大型/快速传播簇人群分别与高危人群进行比较。CRF01_AE网络中以研究对象是否在CRF01_AE亚型网络大型/快速传播簇中作为结局变量,在多因素logistic回归分析中,文化程度、婚姻状况、职业、年龄、户籍地变量间相互校正后,我们发现职业为个体经商(VS.其他)(AOR=1.88,95%CI=1.06-3.31,P=0.030);年龄在 30-39 岁之间(VS.≤24)(AOR=1.90,95%CI=1.17-3.06,P=0.009),年龄在 40-49 岁之间(VS.≤24)(AOR=2.67,95%CI=1.46-4.87,P=0.001),年龄≥50(VS.≤24)(AOR=2.57,95%CI=1.20-5.50,P=0.015);户籍地为沈阳(VS.非沈阳)(AOR=9.76,95%CI=6.58-14.47,P=0.001)为CRF01_AE亚型MSM感染者聚集成大簇/快速传播的独立危险因素。CRF07_BC网络中以研究对象是否在CRF07_BC亚型网络大型/快速传播簇中作为结局变量,在多因素logistic回归分析中,文化程度、职业、户籍地变量间相互校正后,我们未发现CRF07_BC亚型MSM感染者聚集成大簇/快速传播的独立危险因素。B亚型网络中以研究对象是否在B亚型网络大型/快速传播簇中作为结局变量,在多因素logistic回归分析中,文化程度、职业、年龄、户籍地变量间相互校正后,我们发现职业为农民(VS.其他)(AOR=10.37,95%CI=1.42-75.80,P=0.021);户籍地为沈阳(VS.非沈阳)(AOR=43.07,95%CI=10.17-182.34,P<0.001)为 B亚型MSM感染者聚集成大簇/快速传播的独立危险因素。4.3 2008-2016沈阳HIV分子传播网络未成簇个体的相关危险因素分析由于近年来新增感染者中,未成簇感染者所占比例越来越高,我们运用logistic回归进行分析,探索与HIV分子传播网络未成簇个体的相关危险因素。CRF01_AE网络中以研究对象是否为CRF01_AE亚型分子簇外个体作为结局变量,在多因素logistic回归分析中,文化程度、婚姻状况、职业、年龄、户籍地变量间相互校正后,我们发现已婚(VS.未婚)(A0R=1.51,95%CI=1.03-2.23,P=0.037),离异(VS.未婚)AOR=1.97,95%CI = 1.20-3.23,P=0.007);年龄在 25-29 岁之间(VS.≤24)(AOR=1.64,95%CI=1.18-2.28,P=0.003),年龄在 30-39 岁之间(VS.≤24)(AOR=2.68,95%CI=1.87-3.84,P<0.001),年龄在 40-49 岁之间(VS.≤24)(AOR=2.57,95%CI=1.61-4.11,P<0.001),年龄≥50(VS.≤24)(AOR=4.27,95%CI=2.45-7.45,P<0.001);户籍地为沈阳(VS.非沈阳)(AOR=23.04,95%CI=16.26-32.65,P<0.001)为CRF01_AE亚型MSM感染者散在传播的独立危险因素。CRF07_BC网络中以研究对象是否为CRF07_BC亚型分子簇外个体作为结局变量,在多因素logistic回归分析中,文化程度、年龄、户籍地变量间相互校正后,我们发现年龄在 25-29 岁之间(VS.≤24)(AOR=2.06,95%CI=1.08-3.91,P=0.028),年龄在 30-39 岁之间(VS.≤24)(AOR=3.76,95%CI=1.98-7.15,P<0.001),年龄在 40-49 岁之间(VS.≤24)(AOR=3.42,95%CI=1.56-7.52,P=0.002),年龄≥50(VS.≤24)(AOR=2.99,95%CI=1.03-8.70,P=0.045);户籍地为沈阳(VS.非沈阳)(AOR=21.52,95%CI=9.24-50.11,P<0.001)为 CRF07_BC 亚型 MSM 感染者散在传播的独立危险因素。B亚型网络中以研究对象是否为B亚型分子簇外个体作为结局变量,在单因素logistic回归分析中,我们发现仅户籍地沈阳(VS.非沈阳)(OR=22.38,95%CI=5.26-95.19,P<0.001)为B亚型MSM感染者散在传播的独立危险因素。结论:1.本研究采用地区性、大样本、长期观察的回顾性研究,发现沈阳地区三种主要亚型HIV分子传播网络中均存在大型传播簇,近年来新诊断感染者中,总体成簇率成下降趋势,其中CRF01_AE与CRF07_BC毒株成簇率均下降,而B亚型毒株感染者成簇率上升。2.分子传播网络分析提示,从大型快速传播簇新增感染者在新诊断感染者中所占比例不断缩小,扩张簇影响减小,新生簇贡献稳定,静止簇越来越多等变化上看,我国近年来积极的艾滋病治疗与干预措施,一定程度上控制了沈阳地区HIV疫情的快速扩散。3.在积极的治疗干预条件下,与沈阳地区HIV进一步扩散相关的因素包括:已婚、离异、个体经商、年龄25岁以上、户籍地沈阳感染者,今后应重点关注此类人群。4.对于相关因素分析需要加入更多的行为学因素分析,以获得更多有效干预的方向,并且应对不同的传播簇分别进行相关因素分析。