近年来,不孕不育已成为日益严重的社会问题。其中,由于男性因素导致的不育约占到不孕不育总数的一半。2010年诺贝尔生理医学奖颁给英国科学家罗伯特·爱德华兹(Robert Edwards),以表彰其在辅助生殖技术,特别是体外人工受精(In vitro fertilization,IVF)疗法上的卓越贡献。目前,全球超过10%的不育症夫妇通过辅助生殖技术得到健康的子女。但是,由于技术的限制,包括IVF,卵胞浆内单精子注射(Intracytoplasmic sperm injection,ICSI)在内的辅助生殖技术都要求夫妻双方提供成熟且健康的配子。因此对于无精子症导致的男性不育患者,由于没有成熟的雄性配子,不能接受辅助生殖的治疗,目前唯一的解决方式是借助精子库的精子受精,因而不能够得到生物学意义上的子代。而在无精子症患者中,真正的唯支持细胞综合征患者只占到17%,大多数患者睾丸中仍存在正常的精原干细胞(Spermatogonial stem cells,SSCs)。SSCs是睾丸中维持雄性哺乳动物精子发生的成体干细胞,它一方面具有自我更新的能力,另一方面又可以分化出可以进行减数分裂的生殖细胞,最终形成雄性配子。因此SSCs具有临床治疗无精症的潜在价值。在基础研究中,SSCs不但可以作为研究干细胞增殖分化研究的平台。更重要的是,SSCs在基因编辑,获得转基因小鼠上,有着不可替代的优势。由于SSCs所分化出的单倍体雄性配子是遗传物质的直接携带者,因此在SSCs上进行转基因操作再结合生殖细胞移植技术可以非常便利的得到带有转基因的雄性配子,进而方便的得到转基因动物。同时,在对于雄性生殖细胞基因功能的研究中,利用SSCs进行基因敲除,不但可以在体外培养时直接观察所研究的基因对于SSCs增殖及自我更新的影响,更重要的是,通过SSCs的移植实验,可以直接观察基因敲除的SSCs在迁移及后续分化,包括精母细胞减数分裂及精子变形中的表型,比传统的构建基因敲除模型后观察其睾丸中的表型有非常大的便利。本研究针对sscs的这些特性和应用潜能,进行了深入的研究。具体分为三个部分:一、我们在体外建立了三株小鼠sscs细胞系。这些细胞系均可以在体外长期传代培养,仍维持增殖的能力。基因表达分析结果显示sscs细胞系与体内sscs基因表达模式相同。将体外培养的sscs移植到小鼠睾丸的曲细精管中,sscs能够在受体小鼠睾丸中定居,增殖,并进行了正常的精子发生过程。将移植了sscs的受体鼠与野生型母鼠交配或进行icsi后,都可以得到正常出生的,带有与sscs相同的转基因标记的子代动物,证实这些经过体外多代培养的sscs具有良好的发育潜能。二、针对sscs在单倍体生成及转基因操作中的应用,本文进行了一些尝试。传统方法中,要将在体外传代培养的sscs进一步分化成单倍体的精子,需要将其移植到受体小鼠曲细精管的微环境中。而在人类,将体外培养的细胞移植回病人的睾丸存在着安全隐患。同时对于那些睾丸微环境破坏或者睾丸内体细胞不能支持生精的病人来说,sscs睾丸移植不能解决这些问题。因此,其他的使sscs进行精子分化的方法迫切需要被开发出来。sscs在体内所处的微环境需要睾丸内各种体细胞参与构建,因此我们利用sscs和新生小鼠睾丸体细胞在体外聚合,之后移植到受体小鼠的肾包膜下。移植后两周可形成完整的生精上皮结构,并在重构的曲细精管中分选到单倍体细胞。我们利用单倍体的圆形精子细胞进行icsi之后,得到了健康出生的子代小鼠。这些结果说明我们利用睾丸体细胞与在体外长期传代培养的sscs在异位重建了曲细精管的微环境,并维持了正常的精子发生过程,为在体外实现减数分裂得到配子打下了基础。而在基因编辑方面,由于sscs在体外培养时增殖周期长,易于分化且不易接受外源基因整合等特点,对其进行基因编辑十分困难,成功率也非常低。我们尝试使用最新的crisprcas9基因打靶技术,对sscs上进行基因编辑。结果证实,利用crispr-cas9系统,我们成功并高效的敲除了带有gfp标记的sscs中的gfp序列,使sscs荧光消失。此工作证明,利用crispr-cas9系统可以对sscs进行定点的基因打靶,且可以获得较高的效率。三、虽然部分参与SSCs增殖及分化调节的信号通路被揭示出来,但是由特异表达蛋白组成的蛋白质调控网络对SSCs增殖与分化的调控机制仍知之甚少。为了深入了解SSCs中的蛋白质表达情况,从整体水平揭示这些蛋白可能参与的生物学事件,并寻找出SSCs自我更新及分化所依赖的新蛋白分子,我们对已建立的SSCs细胞系进行了蛋白质组学研究,鉴定到一些新的SSCs特异的表面分子,可以用于SSCs的分离和富集,同时鉴定出新的SSCs特异表达蛋白并分析了其可能参与的信号通路,为研究SSCs自我更新及分化的蛋白质调控网络提供了基础。综上,本研究针对SSCs体外培养,应用及蛋白质组学分析做了相关研究,从一定程度上推动SSCs的基础研究及临床应用。