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目的：
原发性肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，具有极高的发病率和死亡率。尽管近年来在肝癌的预防，监测，诊疗和多学科合作等方面均取得了重大突破，但发病率增速与长期生存率仍不容乐观，肝癌诊治仍面临重大挑战。
间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)可响应来自肿瘤的信号，主动迁移至肿瘤组织并参与构成肿瘤微环境(Tumour microenvironment, TME)，同时帮助重塑肿瘤生态位，进而深刻影响肿瘤生长、转移以及对各种治疗的反应。也正是基于MSCs“肿瘤趋向性”和“免疫豁免”的特点，MSCs已经成为抗肿瘤治疗中引人注目的靶点和工具。值得注意的是，MSCs在TME中发挥重要功能的同时，自身命运也受到深刻影响，因此安全性、靶向效率以及重分布等问题同时也制约着MSCs抗肿瘤疗法的进一步推进。但令人遗憾的是，目前极少数研究关注到MSCs自身命运的调控，这对于充分理解TME，解决MSCs抗肿瘤疗法的困境是不利。
因此本研究旨在探索脂肪来源的MSCs(Human adipose-derived MSCs, hAD-MSCs)在长时间暴露于肝癌细胞条件培养基后，细胞表型及糖代谢模式的改变及可逆性，并尝试解释背后的分子机制。
方法：
临床收集健康人群脂肪，提取hAD-MSCs并进行鉴定，并利用Transwell实验验证hAD-MSCs的肝癌归巢能力。采用Hep3B，Huh7，HCCLM3细胞来源的条件培养基体外诱导4-8周，利用WesternBlot以及免疫荧光技术分别检测诱导后hAD-MSCs的α-SMA表达和分布情况。再通过CCK-8、EdU、流式细胞技术以及Transwell分别检测诱导后的hAD-MSCs细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡以及迁移侵袭相关细胞表型的变化，并通过WesternBlot检测线粒体凋亡途径和细胞周期相关蛋白的表达水平。接着利用乳酸、丙酮酸、ATP、葡萄糖摄取和线粒体膜电位检测试剂盒检测诱导后的hAD-MSCs糖代谢模式的相关指标，并通过WesternBlot和RT-qPCR技术检测糖酵解过程中关键蛋白以及对应基因的表达水平。接着我们将诱导后的hAD-MSCs重新置于正常培养基中继续培养2-4周，重复上述表型及糖代谢相关实验，以探索其可逆性。最后我们利用流式细胞技术检测诱导后、脱离后以及NAC(N-acetyl-L-cysteine)处理后的hAD-MSCs胞内ROS水平，并利用WesternBlot检测HIF-1α、MAPK通路(ERK1/2、p38和JNK)和AKT等蛋白表达水平。
结果：
通过检测细胞表面标记及体外分化染色，我们明确从脂肪组织中所提取的细胞确为hAD-MSCs。体外趋化实验同时证实hAD-MSCs具备肝癌归巢的能力。在经肝癌细胞条件培养基诱导4至8周后，hAD-MSCs的α-SMA表达增加，细胞形态向星形转变。CCK-8及EdU结果显示hAD-MSCs增殖能力受到显著抑制，流式细胞结果显示细胞周期(G2/M)被阻滞、细胞凋亡显著增强，相关蛋白检测提示周期调控蛋白表达普遍下调，线粒体凋亡途径被激活。但Transwell结果提示经诱导的hAD-MSCs迁移侵袭能力显著增强。在糖代谢方面，经诱导的hAD-MSCs相对葡萄糖摄取显著增加，乳酸、丙酮酸及ATP相对生成也显著增多，但线粒体膜电位下降明显。WesternBlot、RT-qPCR结果一致，显示大部分糖酵解相关酶蛋白及对应mRNA表达水平上调。有趣的是，当hAD-MSCs脱离相应类肝癌环境后，虽继续维持肿瘤相关MSCs(Tumour-associated MSCs, TA-MSCs)的性质，但相应表型及糖代谢的改变均可发生逆转。
在分子机制方面，流式细胞结果显示经肝癌细胞条件培养基诱导的hAD-MSCs胞内活性氧(Reactive oxygen species, ROS)生成增加，而脱离类肝癌环境后可逆转该效应。同时经诱导的hAD-MSCs，HIF-1α蛋白表达水平明显上调，磷酸化的ERK表达减少，p38及JNK磷酸化水平却明显增加，AKT的磷酸化水平无显著变化。而脱离肝癌环境后，HIF-1α，ERK、p38及JNK磷酸化水平可重新恢复至正常对照水平。若利用NAC清除胞内ROS后，HIF-1α，ERK、p38及JNK激活状态也基本可恢复至正常对照水平。
结论：
hAD-MSCs具备肝癌趋向性，且经肝癌条件培养基诱导后，可向TA-MSCs转化。同时在类肝癌环境压力下，hAD-MSCs增殖受到抑制，细胞周期(G2/M期)被阻滞，线粒体凋亡途径被激活。此外，由于hAD-MSCs线粒体功能受损，驱使糖代谢模式重编程，糖酵解活性增强。但以上表型及糖代谢的改变均可通过脱离类肝癌环境实现逆转。这极有可能是由于环境压力造成hAD-MSCs胞内ROS蓄积，进而激活下游HIF-1α及MAPK信号通路所致。
原发性肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，具有极高的发病率和死亡率。尽管近年来在肝癌的预防，监测，诊疗和多学科合作等方面均取得了重大突破，但发病率增速与长期生存率仍不容乐观，肝癌诊治仍面临重大挑战。
间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)可响应来自肿瘤的信号，主动迁移至肿瘤组织并参与构成肿瘤微环境(Tumour microenvironment, TME)，同时帮助重塑肿瘤生态位，进而深刻影响肿瘤生长、转移以及对各种治疗的反应。也正是基于MSCs“肿瘤趋向性”和“免疫豁免”的特点，MSCs已经成为抗肿瘤治疗中引人注目的靶点和工具。值得注意的是，MSCs在TME中发挥重要功能的同时，自身命运也受到深刻影响，因此安全性、靶向效率以及重分布等问题同时也制约着MSCs抗肿瘤疗法的进一步推进。但令人遗憾的是，目前极少数研究关注到MSCs自身命运的调控，这对于充分理解TME，解决MSCs抗肿瘤疗法的困境是不利。
因此本研究旨在探索脂肪来源的MSCs(Human adipose-derived MSCs, hAD-MSCs)在长时间暴露于肝癌细胞条件培养基后，细胞表型及糖代谢模式的改变及可逆性，并尝试解释背后的分子机制。
方法：
临床收集健康人群脂肪，提取hAD-MSCs并进行鉴定，并利用Transwell实验验证hAD-MSCs的肝癌归巢能力。采用Hep3B，Huh7，HCCLM3细胞来源的条件培养基体外诱导4-8周，利用WesternBlot以及免疫荧光技术分别检测诱导后hAD-MSCs的α-SMA表达和分布情况。再通过CCK-8、EdU、流式细胞技术以及Transwell分别检测诱导后的hAD-MSCs细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡以及迁移侵袭相关细胞表型的变化，并通过WesternBlot检测线粒体凋亡途径和细胞周期相关蛋白的表达水平。接着利用乳酸、丙酮酸、ATP、葡萄糖摄取和线粒体膜电位检测试剂盒检测诱导后的hAD-MSCs糖代谢模式的相关指标，并通过WesternBlot和RT-qPCR技术检测糖酵解过程中关键蛋白以及对应基因的表达水平。接着我们将诱导后的hAD-MSCs重新置于正常培养基中继续培养2-4周，重复上述表型及糖代谢相关实验，以探索其可逆性。最后我们利用流式细胞技术检测诱导后、脱离后以及NAC(N-acetyl-L-cysteine)处理后的hAD-MSCs胞内ROS水平，并利用WesternBlot检测HIF-1α、MAPK通路(ERK1/2、p38和JNK)和AKT等蛋白表达水平。
结果：
通过检测细胞表面标记及体外分化染色，我们明确从脂肪组织中所提取的细胞确为hAD-MSCs。体外趋化实验同时证实hAD-MSCs具备肝癌归巢的能力。在经肝癌细胞条件培养基诱导4至8周后，hAD-MSCs的α-SMA表达增加，细胞形态向星形转变。CCK-8及EdU结果显示hAD-MSCs增殖能力受到显著抑制，流式细胞结果显示细胞周期(G2/M)被阻滞、细胞凋亡显著增强，相关蛋白检测提示周期调控蛋白表达普遍下调，线粒体凋亡途径被激活。但Transwell结果提示经诱导的hAD-MSCs迁移侵袭能力显著增强。在糖代谢方面，经诱导的hAD-MSCs相对葡萄糖摄取显著增加，乳酸、丙酮酸及ATP相对生成也显著增多，但线粒体膜电位下降明显。WesternBlot、RT-qPCR结果一致，显示大部分糖酵解相关酶蛋白及对应mRNA表达水平上调。有趣的是，当hAD-MSCs脱离相应类肝癌环境后，虽继续维持肿瘤相关MSCs(Tumour-associated MSCs, TA-MSCs)的性质，但相应表型及糖代谢的改变均可发生逆转。
在分子机制方面，流式细胞结果显示经肝癌细胞条件培养基诱导的hAD-MSCs胞内活性氧(Reactive oxygen species, ROS)生成增加，而脱离类肝癌环境后可逆转该效应。同时经诱导的hAD-MSCs，HIF-1α蛋白表达水平明显上调，磷酸化的ERK表达减少，p38及JNK磷酸化水平却明显增加，AKT的磷酸化水平无显著变化。而脱离肝癌环境后，HIF-1α，ERK、p38及JNK磷酸化水平可重新恢复至正常对照水平。若利用NAC清除胞内ROS后，HIF-1α，ERK、p38及JNK激活状态也基本可恢复至正常对照水平。
结论：
hAD-MSCs具备肝癌趋向性，且经肝癌条件培养基诱导后，可向TA-MSCs转化。同时在类肝癌环境压力下，hAD-MSCs增殖受到抑制，细胞周期(G2/M期)被阻滞，线粒体凋亡途径被激活。此外，由于hAD-MSCs线粒体功能受损，驱使糖代谢模式重编程，糖酵解活性增强。但以上表型及糖代谢的改变均可通过脱离类肝癌环境实现逆转。这极有可能是由于环境压力造成hAD-MSCs胞内ROS蓄积，进而激活下游HIF-1α及MAPK信号通路所致。