【摘 要】
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N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAGase）存在于多种动物精浆和精子中,有报道其参与人、鼠精卵识别的初始阶段穿越透明带,但有关NAGase活力对猪精子的质量和受精作用影响的生化机制未见报道。本课题组已分离纯化获得杜洛克猪精液NAGase纯酶并筛选出多种可调控酶活性的效应物。本研究项目拟在前期研究的基础上,用已筛选的效应物调控NAGase活力,研究NAGase活力对精子运动参数和顶体完整性的影响
【基金项目】
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国家自然科学基金项目支持,项目名称为猪精液NAGase活力对受精过程中精子与受体识别的影响及分子机制
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N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAGase）存在于多种动物精浆和精子中,有报道其参与人、鼠精卵识别的初始阶段穿越透明带,但有关NAGase活力对猪精子的质量和受精作用影响的生化机制未见报道。本课题组已分离纯化获得杜洛克猪精液NAGase纯酶并筛选出多种可调控酶活性的效应物。本研究项目拟在前期研究的基础上,用已筛选的效应物调控NAGase活力,研究NAGase活力对精子运动参数和顶体完整性的影响。研究结果将深入阐明NAGase对精子生理活性的调控机制,为探索改善猪精液品质、提高受精率和繁殖性能的有效途径提供科学理论依据。本研究通过RT-PCR和Western-blot实验技术检测了 NAGase基因的转录水平和蛋白的表达情况。此外,我们还通过免疫组化和免疫荧光技术定位了 NAGase在睾丸和精子中的分布,得到了以下结果:（1）NAGase广泛存在于猪的多种组织中,其中小肠和睾丸内含量相对丰富。（2）睾丸内的间质细胞和曲细精管中均存在着大量的NAGase,曲细精管中的支持细胞中也含有丰富的NAGase,且NAGase位于精子的头部以及尾部。（3）我们通过综合分析NAGase活力对精子的六个运动参数的影响,具体为VAP、VCL、VSL、ALH、BCF和STR,发现稀释液成分中调控NAGase活力的效应物对精子的运动性能会产生一定的影响。维生素C在提高NAGase酶活的浓度范围内促进了精子的运动性能,其中1.8mmol/L的维生素C和精子孵育45min能极显著的提高精子运动性能,且作用效果最大;葡萄糖、柠檬酸钠和碳酸氢钠则分别在降低NAGase酶活的情况下,降低了精子的运动性能。具体结果为70mmol/L的葡萄糖和精子孵育60min能极显著的降低精子的运动性能,且作用效果最大;90mmol/L的柠檬酸钠和精子孵育60min能极显著的降低精子的运动性能且作用效果最大;浓度为12mmol/L的碳酸氢钠和精子孵育60min能极显著的降低精子的运动性能且作用效果最大。（4）稀释液成分中调控NAGase活力的效应物对精子的顶体完整性能产生一定的影响。随着VC浓度的增加,精子的顶体完整率与其前向运动的精子比率均呈现上升趋势。不同浓度VC作用下的精子顶体完整率与前向运动比率均不完全相同（F=4.720,P=0.021;F=19.714,P<0.001）,精子顶体完整率与前向运动比率呈正相关关系（r=0.661,P=0.005）;随着葡萄糖浓度的增加,精子的顶体完整率几乎没有变化,前向运动比率呈下降趋势。不同浓度葡萄糖作用下的精子顶体完整率几乎相同（F=3.117,P=0.066）,与前向运动比率不完全相同（F=162.651,P<0.001）,另外精子顶体完整率与前向运动比率呈正相关关系（r=0.575,P=0.020）;精子的顶体完整率与前向运动的比率都随着柠檬酸钠浓度的升高而呈下降趋势,不同浓度柠檬酸钠作用下的精子顶体完整率与前向运动比率均不完全相同（F=4.895,P=0.019;F=101.081,P<0.001）,其中精子顶体完整率与前向运动比率呈正相关关系（r=0.679,P=0.004）;随着碳酸氢钠浓度的增加,精子的顶体完整率与前向运动的精子比率都有下降,不同浓度碳酸氢钠作用下的精子顶体完整率与前向运动比率均不完全相同（F=5.314,P=0.015;F=387.701,P<0.001）,精子顶体完整率与前向运动比率呈正相关关系（r=0.757,P=0.001）。综上所述,稀释液成分中NAGase的酶活效应物在调控NAGase活力时对精子的运动性能和顶体完整性也有一定的作用。维生素C在提高NAGase酶活的同时促进了精子细胞的运动性能、顶体完整性,从而使精子的前向性提高;而葡萄糖、柠檬酸钠和碳酸氢钠则分别在降低NAGase酶活的浓度范围内,均使精子的运动性能和顶体完整率降低。
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