论文部分内容阅读
小黑杨(Populus simonii ×Populus nigra)是杨柳科杨属乔木,具有抗旱、耐寒、耐瘠薄等优良性状,是北方推广的造林树种。丙氨酸氨基转移酶(Alanine Aminotransferase,AlaAT)是一种磷酸吡哆醛依赖性的转移酶,在植物碳氮代谢平衡中起关键性作用。本研究利用生物信息学方法,在杨树基因组数据库中鉴定了谷丙转氨酶基因家族的4个同源基因。以小黑杨为试材克隆了PnAlaAT1-4基因,并且对获得的cDNA的核苷酸序列、编码蛋白的氨基酸序列进行了生物信息学分析。同时,利用实时定量PCR方法鉴定了PnAlaATs基因的组织表达特异性及其在不同氮素条件、日节律及光照等条件下的表达模式。构建pROK Ⅱ-PnAlaAT3植物表达载体后通过农杆菌介导法遗传转化小黑杨,获得了 17个转基因株系。主要研究结果如下:(1)利用生物信息学方法,在毛果杨基因组数据库中鉴定了 AlaAT基因家族的4个成员。系统进化树分析表明,该家族含有2个亚家族,PtAlaAT3和PtAlaAT4属于亚家族A,编码谷丙转氨酶;PtAlaAT1和PtAlaAT2属于亚家族B,编码谷氨酸:乙醛酸氨基转移酶。(2)利用RT-PCR方法成功克隆了小黑杨AlaAT基因家族的4个成员。PnAlaAT1-4的cDNA全长核苷酸序列均为1446 bp,编码481个氨基酸残基;PnAlaATs基因在GenBank 数据库中的登录号分别为 KT768060、KT768061、KT768062 和 KT768064。同源性比对结果显示,4个PnAlaAT基因与毛果杨中相应的AlaAT基因的核苷酸序列一致性均为99%,蛋白质的氨基酸序列一致性为100%。(3)荧光定量PCR结果表明,正常条件下,PnAlaAT1和PnAlaAT2主要在叶片中表达;氮素处理时,PnAlaAT1和PnAlaAT2在叶片中的表达受外源氮素诱导,而在根中的表达受外源氮素抑制;叶片中PnAlaAT1和PnAlaAT2基因的转录水平随着昼夜变化出现规律性波动。正常条件下,PnAlaAT3和PnAlaAT4在根、茎、叶中均表达;氮素处理时,在小黑杨根、茎和叶组织中,PnAlaAT3和PnAlAT4基因均受外源氮素诱导表达,PnAlaAT3基因在根中的表达受10 mmol/L NH4+显著诱导。另外,小黑杨根中谷氨酸合成酶被抑制剂抑制后,PnAlaAT3基因的表达受谷氨酰胺诱导。(4)成功构建了植物表达载体pROK Ⅱ-PnAlaAT3,通过农杆菌介导遗传转化小黑杨后获得了 17个转基因株系。PCR及荧光定量检测表明,PnAlaAT3基因已经成功整合到小黑杨基因组中并表达。本研究为深入阐释木本植物丙氨酸氨基转移酶在氮素吸收利用过程中的功能奠定了试验基础。