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赤霉素在植物种子萌发,开花,果实成熟等发育过程中起重要作用。类胡萝卜素是维生素A的前体,是许多花和果实中的重要色素。本课题围绕植物的一个表型:花菜Dr(Drange)突变体植株矮化和开花延迟,展开了对高等植物赤霉素和类胡萝卜素生物合成途径关系的研究。有报道表明,新基因Or与类胡萝卜素积累相关。赤霉素和类胡萝卜素生物合成途径都来源于异戊二烯代谢途径,牻牛儿基牻牛儿基二磷酸(geranylgeranyl diphosphate,GGPP)是它们的共同前体,因而我们推测,可能在Or突变体中赤霉素和类萝卜素合成途径的代谢流发生变化,导致Or突变体中活性赤霉素含量低于野生型,同时类胡萝卜素积累。
为了比较分析野生型花菜和花菜Or突变体中活性赤霉素素(gibberellins,GA)含量的差异,我们进行了表型分析实验和半定量PER实验。表型结果显示,在全黑暗条件下4天,野生型花菜的下胚轴和根比花菜Or突变体长[p<0.05)。半定量PER结果显示,全黑暗4天花菜Or突变体中GA4基因比野生型花菜GA4基因表达量高,说明在全黑暗4天条件下,花菜Or突变体中活性GA的含量较野生型花菜活性GA含量下降(GA4基因的表达量与活性赤霉素含量呈反比)。半定量PCR与表型分析结果一致。
为了进一步研究野生型花菜和花菜Or突变体中赤霉素合成途径上关键酶基因的表达差异,我们进行了定量PCR实验。结果表明,当花菜经4天黑暗后见光1小时、2小时、4小时,Or突变体和野生型的GGPP合成酶基因(GGPS1)表达量均呈总体上升趋势;见光1小时和2小时,GGPS1基因在野生型花菜中的表达量高于该基因在Or突变体中的表达量;见光4小时,GGPS1基因在花菜Or突变体中的表达量上升并高于野生型花菜中GGPS1基因的表达量。
定量PCR实验还表明,4天黑暗后见光1小时,野生型花菜中CPS基因(编码内根-古巴焦磷酸合成酶)的表达量明显高于该基因在Or突变体中的表达量;见光2小时后这种差异还存在,但程度下降;见光4小时,该基因表达量在野生型和突变体中一致。CPS基因的表达量变化趋势与GGPS1基因相似。CPS是赤霉素合成途径上的第一个限速酶,我们推测,CPS基因在赤霉素合成途径和类胡萝卜素合成途径的协同作用和代谢流改变上起着关键性的作用。而赤霉素合成途径上的其它编码关键酶的基因,KS、KO、KAO1、KAO2在野生型花菜和花菜Or突变体中未呈现明显表达差异。
为了进一步研究类胡萝卜素合成途径对赤霉素合成途径的影响,我们对拟南芥进行了NF(norflurazon,抑制八氢番茄红素合成酶)处理,并比较了赤霉素合成途径上编码关键酶基因的表达差异。结果显示,转化空载体的拟南芥植株,被NF处理过后CPS表达量明显高于未被NF处理的植株。被NF处理过的植株中GA4表达量明显低于未被NF处理的植株。这些都说明了,NF在抑制类胡萝卜素合成途径的同时促进了活性赤霉素的生物合成。
Geneverstigator数据库分析显示,拟南芥在开花阶段赤霉素合成途径上CPS基因表达量明显高于其他各生长阶段。这就补充解释了本论文需要论证的一个表型:纯合Or突变体开花延迟。推测代谢流改变模式可能为:在拟南芥开花阶段,野生型植株CPS基因表达量很高,但是在Or突变体中,Or基因通过某种方式影响CPS基因的表达,从而导致活性GA的合成下降,这样共同前体GGPP更多的合成类胡萝卜素,导致类胡萝卜素的大量积累和拟南芥的开花延迟。