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传统中药淫羊藿用于促进生殖健康已有悠久的历史。草药淫羊藿常被用于治疗内分泌紊乱、性冷淡、不育、老龄功能障碍、性腺机能障碍、雄性阳痿以及改善雌性健康。淫羊藿也被用作催情药,据报道可改善老龄大鼠的勃起功能。淫羊藿在人类和动物都有使用,在动物上它被认为可促进生殖功能而获此名。淫羊藿多糖和淫羊藿苷是淫羊藿的主要有效成分,淫羊藿苷属黄酮类物质,用于草药的质量控制。本试验旨在研究淫羊藿水提液(EP)、淫羊藿多糖(EPS)淫羊藿苷(ICA)对昆明小鼠雌性生殖发育的作用和机理。首先,通过分析生殖指数来评价淫羊藿及其主要有效成分对卵巢和子宫发育的影响。采用卵母细胞体外成熟评价处理前后的第一极体(pbI)排出率、体外受精率和胚胎发育率。并用放射性免疫测定法分析血清激素(E2和P4)水平,qRT-PCR技术分析卵巢基因mRNA表达,免疫组化(IHC)和western blot分析卵巢蛋白表达。我们开展了 2部分试验,第3和第4章为第1部分试验:360只小鼠随机分为30组,每组12只。8组分别每天灌服2、6、10和14 mg/0.1 ml淫羊藿水提液(EP),连续灌服7和14 d;8组分别用2、4、6和8 mg/0.1 ml淫羊藿多糖(EPS)连续灌服7和14 d;8组分别用0.1、0.3、0.5和0.8 mg/0.1 ml淫羊藿苷(ICA)连续灌服7和14 d,并分别设置生理盐水对照组连续灌服0.1 ml生理盐水7和14 d。第2部分试验为480只小鼠随机分为12组,连续灌服7和14 d的EP 10 mg/0.1 ml、EPS 6 mg/0.1 ml和ICA 0.5 mg/0.1 ml试验组及相应的0.9%生理盐水对照组。试验一、淫羊藿及其有效成分对小鼠卵巢发育的影响总体上说,淫羊藿水提液(EP)、EPS和ICA处理组所获生殖指数均高于对照组。淫羊藿水提液(EP)处理组所获最佳生殖指数在灌服14 d组均高于灌服7 d组,这个差异可能是由于14 d处理组小鼠用药时间长所致。连续7 d灌服6、10和14 mg EP,所获生殖指数均较对照组有所提高,但差异不显著(P>0.05);连续14 d灌服2、6、10和14 mg EP生殖指数也较对照组增加,用10 mg EP连续灌服7或14 d,所获生殖指数处于第2高的水平;EPS组生殖指数4 mg灌服7 d最高,其次是灌服14 d。ICA0.7mg组连续灌服14 d生殖系数最高,其次是ICA0.5 mg连续灌服14组。EP 10 mg连续灌服7 d组所获卵母细胞体外成熟率与对照组相比最高(75.4%),而EP 6 mg组连续灌服14 d成熟率为70.7%;EPS 8 mg组连续灌服7 d成熟率为80%,并高于14 d成熟最高的EPS 6 mg组的60%。连续灌服7 d,ICA 0.5 mg组的成熟率为75%,ICA0.3 mg组连续灌服14 d成熟率高可达68.1%。试验二、淫羊藿及其有效成分处理后小鼠类固醇激素的变化本试验分析了淫羊藿及其有效成分对类固醇激素变化的影响。结果显示,与对照组相比连续灌服EP 7和14 d处理组血清17β-E2和P4水平均未发生明显的变化(P>0.05);与对照组相比EPS和ICA处理组的血清17β-E2和P4水平也无显著改变(P>0.05);但连续灌服7 d EPS 2 mg组血清17β-E2和P4水平与14 d相比则差异显著(P<0.05),而ICA 0.7 mg连续灌服14 d血清17β-E2水平与7 d相比显著增加(P<0.05),0.1 mg ICA连续灌服7 d组的血清P4水平显著提高(P<0.05)。依据上述结果选出的最佳处理剂量分别为10 mg EP、6 mg EPS和0.5 mg ICA。试验三、淫羊藿对小鼠卵巢基因与蛋白表达的影响为了评价EP对小鼠卵巢作用的机制,采用RT-qPCR分析类固醇合成相关基因(Cyp19a1,Hsd1 7b1 or Star)和生长因子基因(Egf,Igf-2,Ptgs-2,Vegfa,and Tyk-2),免疫组化和western blot技术检测相关受体的表达(ERα,ERβ and PRA)。EP灌服7 d组卵巢Hsd1 7b1(2.5倍)、Igf-2(2.4倍)和Ptgs-2(3.4倍)基因表达量与对照组相比变化显著,而EP灌服14 d组卵巢的Cyp19a1(8倍)、Egf(10倍)和Igf-2(69倍)表达较对照组显著提高。连续灌服7 d各基因表达量变化0.5-3.4倍,连续灌服14 d各基因表达量变化在0.6-69.4倍。免疫组化分析表明,10 mg EP灌服7 d组与对照组相比卵巢ERα表达量增加,但ERβ和PRA表达量下降。连续灌服14d,EP 10 mg处理组卵巢ERβ表达量高于ERα。采用western blot分析了ERα,ERβ和PRA的表达类型,表明EP处理7或14 d组的卵巢ERα表达量与对照组无明显差异(P>0.05),但ERβ和PRA表达量较对照组显著降低(P<0.05)。EP处理增加了Igf-2和Egf基因表达,考虑到EGF与雌激素受体α(ERα)的互作关系,EGF可能通过结合并活化ERα而导致卵巢的变化。试验四、淫羊藿多糖(EPS)对小鼠卵巢基因与蛋白表达的作用为了评价EPS对卵巢的作用,相对表达量2倍以上的上调基因被看作有显著差异。这些基因在EPS灌服7d组有Cyp19a1(2.7倍)、Hsd17b1(2.2倍)、Igf-2(2.8倍)和Tyk-2(2.1 倍);在 EPS 灌服 14 d 组有Cyp19a1(4.5 倍)、Hsd17b1(3.2 倍)、Igf-2(15倍)和Ptgs-2(85倍)。连续灌服7 d各基因的表达量变化为0.8-2.8倍,连续灌服14 d各基因表达量的变化在0.5-85倍。免疫组化结果表明,连续7 d灌服6 mg EPS组卵巢ERα着色较对照组更深;连续灌服14 d组卵巢三级卵泡颗粒细胞ERβ着色较ERα深,并且6 mg EPS组卵泡内散落的颗粒细胞也有ERα表达。连续7 d灌服6 mg EPS组卵巢ER(ERα和ERβ)表达量与14 d相比有所增加,泡膜细胞PRA表达弱;连续7或14 d灌服6 mg EPS组卵巢ERα表达量与对照组相比均显著提高(P<0.05)。此外,EPS 6 mg组连续灌服14 d卵巢ERβ表达也较对照组显著增加(P<0.05);连续灌服7或14 d,EPS 6 mg组的卵巢PRA表达量与对照组相比均显著下降(P<0.05)。EPS的作用模式与EP有所不同。本试验发现,EPS通过改变基因mRNA水平、雌激素和孕激素受体蛋白表达从而影响类固醇生成和卵泡发育。EPS明显提高Ptgs-2和Igf-2基因的表达。试验五、淫羊藿苷(ICA)影响小鼠卵巢的基因与蛋白表达本试验对ICA作用于卵巢的评价主要集中于基因与蛋白表达上。采用上述方法研究发现,与对照组相比连续7 d灌服ICA组卵巢Cyp19a1(34倍)、Hsd17b1(3.2倍)、Igf-2(33倍)和Ptgs-2(19倍)基因表达量均有显著上调;灌服14 d组的卵巢Egf(4倍)、Ptgs-2(3.2倍)和Tyk-2(10倍)显著上调。Star、Hsd1 7b1和Tyk-2表达量未见明显变化。Vegfa和Egf基因表达下调,但差异不显著。免疫组化结果显示:连续7 d灌服0.5 mg ICA组三级卵泡中卵母细胞周围的细胞ERα着色明显加深,但与基膜和泡膜细胞着色变浅。连续灌服0.5 mg ICA 7或14 d,卵母细胞、颗粒细胞、初级卵泡、次级和三级卵泡及黄体均有ERα表达,但泡膜细胞均无ERα、ERβ和PRA的表达。处理组一些黄体细胞质中有微弱的PRA表达。处理组卵巢ERα表达较对照组明显要高,但PRA却在对照组表达较高。western blot结果表明,连续灌服0.5 mg ICA 7 d,卵巢ERα表达量比对照组显著增加(P<0.05),但处理14 d组的ERα表达量反而显著下降(P<0.05)。连续灌服0.5 mg ICA 7或14 d,卵巢ERβ和PRA表达与对照组相比均显著下降(P<0.05)。ICA可能借助于提高类固醇合成相关基因(如Hsd17b1和Cyp19a1)或其他基因的表达,经雌激素受体途径调节卵泡发育。ICA处理7d会使ERα表达明显提高。ICA处理更久可能会有负面的作用,反而降低了受体的表达。综上所述,淫羊藿及其有效成分EPS和ICA的确影响小鼠的生殖发育。它们可能正面影响生殖系数和体外发育率,进而作用于卵巢卵泡的发育。淫羊藿及其有效成分EPS和ICA作用的途径可能是不一样的,但都是通过改变相关基因和蛋白(如Ptgs-2、Igf-2、Egf和ERα)的表达而发挥作用。