肝细胞癌(以下简称肝癌)占原发性肝癌的80%以上,是最常见的恶性肿瘤之一。肝癌起病隐匿,恶性程度极高,现有的筛查与早期诊断方式对肝癌诊断灵敏度不高,亟需探寻更有效的诊断标志物。肝切除术仍然是最佳的治疗选择,但术后5年生存率仅为30-50%,复发转移率则超过60%,因此筛选对肝癌患者总体生存及复发有预测作用的标志物,对术后的个体化监测与治疗具有重要意义。代谢组学致力于研究生物体对环境、疾病以及遗传变异等压力因素影响的最终应答,它的提出为发现潜在肿瘤标志物提供了新思路。目前已有学者利用色谱、质谱、核磁共振等技术平台从患者血液、尿液、组织等标本中寻找代谢差异,发现潜在的肝癌标志物,但绝大多数研究只采用了非靶向代谢组学研究,而且只分析了单一种类的生物样本,其器官靶向性与临床应用受到极大限制。在本研究中,通过结合非靶向与靶向代谢组学分析方法,对肝癌组织与血清样本中的代谢物进行检测,筛选具有器官靶向性的诊断与预后标志物。在本研究的第一部分,对312例肝脏组织(156对肝癌与癌旁)进行了代谢组学分析,通过两步萃取法对亲水性与亲脂性代谢物分别提取检测,建立正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)模型。对于亲水性代谢物,在电喷雾(ESI)正离子与负离子模式下,其模型解释率R~2Y分别为0.743与0.865,预测率Q~2为0.719与0.847;对于亲脂性代谢物,在ESI正离子与负离子模式下,其R~2Y分别为0.790与0.832,Q~2为0.766与0.809。R~2Y与Q~2提示模型解释率与预测率较好,对数据进行200次重采集验证模型不存在过度拟合现象。根据代谢组学中常用的多变量与单变量统计的筛选标准,即变量重要性(VIP)>1与两组间样本比较P<0.05,并在公共数据库中进行一级与二级质谱片段的比对,共得到138种差异代谢产物,其中35种小分子代谢物在肝癌组织中明显升高,103种代谢物在肝癌组织中明显降低。差异代谢物的种类主要包括碳水化合物、胆汁酸、肉碱、嘌呤、脂肪酸与各类脂质。本研究将筛选的138个差异代谢产物进行代谢通路富集与分析,匹配到多条发生改变的代谢通路与网络,主要参与体内葡萄糖平衡代谢、能量代谢、免疫调节与炎症反应等。在本研究的第二部分,对138种代谢物进行了受试者工作曲线(ROC)分析以筛选具有诊断价值的代谢物。曲线下面积(AUC)在0.8-0.9区间的代谢物有45种,AUC大于0.9以上的代谢物有11种。视黄醇的AUC高达0.991,远高于其他差异代谢物,同时其相对含量在肝癌组织中下调15.56倍。为了更全面的探索视黄醇的临床价值,本研究对视黄醇在肝癌组织的含量与相应临床变量进行了Spearman相关性分析,发现视黄醇的相对含量与肝癌的病理分级有负相关性(r=-0.553,P<0.001),表明视黄醇与肝癌细胞的分化有密切关系并且肝癌恶性程度越高视黄醇的相对含量越低。因此视黄醇具有重要的诊断与预后价值,靶向代谢组学研究对视黄醇及其代谢通路展开。优化肝脏组织与血清样品前处理过程、色谱与质谱条件后,对肝脏组织与血清样本中视黄醇、视黄醛、视黄酸、视黄醇酯与胡萝卜素构建标准曲线,其拟合度良好,均高于0.99,并且精密度与准确度的偏差均符合靶向代谢组学的方法学要求。本研究建立了稳定的视黄醇代谢物靶向代谢组学方法后,在肝脏组织与血清中定量检测每种代谢物的具体含量。在肝脏组织中,视黄醇、视黄醛、视黄酸、视黄醇酯与胡萝卜素在正常肝组织、肝硬化组织中的含量均高于肝癌组;在肝癌的不同亚组中,其含量由I级到IV级逐渐降低。在血清中,视黄醇、视黄醛与视黄醇酯在健康对照、肝硬化的含量均高于肝癌组;在肝癌的不同亚组中,其含量由I级到IV级逐渐降低。对上述5种视黄醇代谢物的诊断与预后能力的评价中发现,视黄醇、视黄醛、视黄醇酯与胡萝卜素对肝癌与正常肝组织,肝癌与肝硬化组织的AUC均接近于1.0;视黄酸对肝癌的鉴别能力相对其他4种代谢物较弱,但其AUC也高于0.8,仍具有较强的诊断效能。每种代谢物根据其含量中位数分为高表达组与低表达组进行Kaplan-Meier生存分析,肝癌组织中低表达的视黄醇、视黄醛、视黄酸、视黄醇酯与胡萝卜素对应的患者生存期较短,并具有显著的统计学意义,因此在肝癌组织中的视黄醇、视黄醛、视黄酸、视黄醇酯与胡萝卜素含量均具有很强的诊断与预后指示的作用。在血清样本中,只有视黄醇、视黄醛与视黄醇酯对肝癌与健康对照及肝硬化的AUC仍高于0.8,但视黄醇酯的含量与肝癌患者的生存时间没有显著的相关性。视黄醇与视黄醛在肝癌组织与血清中均具有良好的诊断与预后指示能力,因此本研究联合视黄醇与视黄醛通过logistic回归分析建立代谢物组合以获得在血清中诊断与预后指示灵敏度更高的标志物,以最大约登指数所对应的值为最佳的临界值即1.572。肝癌与健康对照的鉴别诊断中,代谢物组合的AUC、诊断灵敏度与特异度分别为0.933(95%CI 0.882-0.984),85%与90%;肝癌与肝硬化的鉴别诊断中,代谢物组合的AUC诊断灵敏度与特异度分别为0.853(95%CI 0.776-0.927),75%与95%,均优于传统的诊断标志物甲胎蛋白(AFP)。对于所有肝癌患者该代谢物组合的诊断准确度为90%,对AFP阴性的肝癌患者其诊断准确度为66.7%;对于所有肝硬化患者该代谢物组合的诊断准确度为85%,对AFP阳性的肝硬化患者其诊断准确度为75.6%。通过Kaplan-Meier生存分析发现以代谢物组合中位数分为两组的肝癌患者生存时间具有明显的差异(P<0.001)。在单因素与多因素Cox分析中,代谢物组合为肝癌预后生存的独立危险因素(P<0.05),其风险比(HR)为2.888(95%CI 1.552-5.374)。在本研究的第三部分,对训练组(250对乙肝相关性肝癌与癌旁)与验证组(250对乙肝相关性肝癌与癌旁)中的肝脏组织样本进行非靶向代谢组学检测。在ESI正离子模式下,训练组与验证组OPLS-DA模型解释率R~2Y分别为0.763与0.746,预测率Q~2分别为0.753与0.736。在ESI负离子模式下,训练组与验证组R~2Y分别为0.866与0.885,预测率Q~2分别为0.859与0.878。对上述训练组与测试组模型进行200次数据重采集内部验证,该模型无过度拟合。与第一部分中同样的筛选条件,两组共有的差异代谢产物为29种。通过LASSO回归与Cox模型筛选训练组数据集中与肝癌复发相关的危险变量,得到13种代谢物,并根据这13种代谢物在回归分析中的权重,构建了基于代谢特征的肝癌复发风险评分公式,对训练集中的每位患者进行打分。以训练集中250位肝癌患者的中位分数为临界值(-1.03),将肝癌患者分为高危组与低危组。在验证集中,同样基于此公式为每位患者打分,以上述训练组中临界值为准,将患者分为高危组与低危组。通过Kaplan-Meier法对高危组与低危组的复发率进行比较。在训练组与验证组中,高危组的总体复发率均显著高于低危组的总体复发率(P<0.001)。在训练集中将风险评分与所有临床变量纳入单因素与多因素Cox回归分析,确认术前AFP表达量(HR=1.458,P=0.035)、最大肿瘤直径(HR=1.007,P=0.001)、肿瘤数量(HR=2.027,P=0.003)、微血管侵犯(HR=1.554,P=0.016)以及代谢物风险评分(HR=5.033,P<0.001)这5种变量为肝癌复发的独立危险因素,并基于上述变量建立乙肝相关性肝癌预测复发列线图,并由验证组数据集对该列线图进行验证。训练组与验证组中,C指数分别为0.784(95%CI 0.753-0.815)与0.754(95%CI0.753-0.815),并且列线图矫正曲线均拟合良好,因此该列线图可用于乙肝相关性肝癌复发的个体化预测。综上所述,本研究建立了稳定的非靶向与靶向代谢组学分析平台,通过对肝脏组织与血清样本的检测,筛选并验证了视黄醇类代谢物对肝癌具有较好的诊断能力,并且对肝癌患者的术后生存时间有一定的指示作用;同时也建立了基于代谢特征的乙肝相关性肝癌复发风险评分,并与传统预后因素结合构建预测术后复发的列线图,对肝癌术后复发个体化预测与辅助治疗提供帮助。