论文部分内容阅读
研究背景脑卒中即脑血管意外（包括缺血性和出血性）涉及全球人民的身体健康,成为全世界第二大死亡原因和第三大致残病因。另外,伴随着人口老龄化及各种外界环境的变化,全球脑卒中负担正在逐渐增加,使得脑卒中的预防及治疗具有重大意义。缺血/再灌注（Ischemia/reperfusion,I/R）或者脑出血（Intracerebral hemorrhage,ICH）引起的血脑屏障（Blood-brain barrier,BBB）损伤是造成血管源性脑水肿、脑疝以及出血性转化的直接原因。因此,脑卒中后BBB的保护是改善患者生活质量的关键策略之一。基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinase,MMP）被认为是细胞外蛋白酶的一种,在血管生成,胚胎重塑,伤口愈合等方面均有重要作用,而在病理过程中,MMP能够降解各种基质成分,因此MMP的异常活性可导致组织损伤。迄今为止,文献报道了24种MMP的同源物,而基质金属蛋白酶9（MMP-9）已经被证实在脑卒中后损伤基底膜和降解紧密连接蛋白过程中起关键作用。除此之外,ICH后MMP-9会急剧升高,作为关键的炎症相关因子,能加速分解神经间质成分,使炎症因子的播散更快且范围更广,从而导致炎性反应的进展加剧,引起严重的神经功能损伤。既往研究表明,患有缺血性卒中的MMP-9基因敲除小鼠相比于野生型（WT）小鼠有更佳预后。此外,同样发现MMP-9参与脑外伤后继发性脑损伤。据既往研究报道,抑制MMP-9的过表达,是治疗脑卒中后脑损伤的有效方法。MMP-9 monoclonal antibody（L13）是由加利福尼亚大学河滨分校的Xin GE教授开发的MMP-9特异性单克隆抗体,作为MMP-9的特异性抑制剂,对MMP-2、MMP-12、MMP-14并不产生抑制作用。诸多证据显示,抑制MMP-9的产生可以减轻小鼠ICH后脑水肿并同时改善神经功能损伤,而在体外实验中,加入MMP-9刺激,BBB结构破坏严重。有证据显示,L13通过抑制MMP-9活性在缓解小鼠神经疼痛方面具有显著作用,但在急性脑卒中后是否能通过抑制MMP-9的活性进而发挥BBB保护作用尚未见报道。目的在本研究中,我们使用Ⅶ型胶原酶诱导的小鼠ICH模型和线栓法构建的小鼠大脑中动脉栓塞（Middle cerebral artery occlusion,MCAO）模型评估L13对急性脑卒中后BBB结构和神经功能的影响,并讨论其分子机制。同时验证药物L13与患者血清共孵育之后是否能够降低其中MMP-9的活性,为药物的临床转化奠定基础。方法1.以胶原酶诱导的小鼠ICH模型/线栓法构建MCAO模型,在48h检测脑组织伊文思蓝的外渗情况来评估BBB的完整性。2.在建立ICH模型/MCAO模型后,将L13以5mg/kg的剂量通过眼眶后静脉注射。3.应用免疫蛋白印迹法（Western blot,WB）,比较脑出血模型和缺血再灌注模型构建后48h不同组别中（Sham;Control;L13）MMP-9,ZO-1,Occludin,Claudin-5,Collagen IV,Laminin蛋白的表达变化。4.应用免疫组织荧光（Immunofluorescence,IF）,比较脑出血模型和缺血再灌注模型构建后48h不同组别中（Sham;Control;L13）ZO-1,Claudin-5,Collagen IV,Laminin与内皮细胞（CD31）的共染情况;同时通过Ig G的渗漏表现来评价血脑屏障的渗漏情况。5.应用明胶酶谱法与原位酶谱法,比较脑出血模型和缺血再灌注模型构建后48h不同组别中（Sham;Control;L13）MMP-9的活性变化情况。6.采用神经功能废损评分和神经行为学测试（包括爬梯试验、转棒行走试验和抓握试验）来评价小鼠神经功能状况。7.收集脑出血/脑梗塞患者术前血清,与L13共孵育,应用明胶酶谱法观测药物对患者血清中MMP-9的效用。结果1.在ICH模型中,与Control组相比,L13治疗组基底节区血肿体积在ICH后48h明显减少（P<0.001）。同时,L13治疗组基底节区伊文思蓝外渗在ICH后48h明显减少（P<0.05）。ICH后48h的神经功能检查显示,L13治疗组神经功能废损情况明显减轻（P<0.05）;通过Western blot,与Sham组相比,Control组血脑屏障相关蛋白的表达显著降低（ZO-1:P<0.05;Occludin:P<0.01;Claudin-5:P<0.01;Collagen IV:P<0.01）;与Control组相比,L13治疗组中血脑屏障相关蛋白的表达显著增加（ZO-1:P<0.05;Occludin:P<0.05;Claudin-5:P<0.05;Collagen IV:P<0.05）。通过免疫荧光染色技术,与Sham组相比,Control组血脑屏障相关蛋白的表达显著降低（ZO-1:P<0.001;Claudin-5:P<0.001;Collagen IV:P<0.001）;与Control组相比,L13治疗组中血脑屏障相关蛋白的表达显著增加（ZO-1:P<0.001;Claudin-5:P<0.01;Collagen IV:P<0.001）,同时,经L13干预后Ig G渗漏情况也有明显改善（Ig G:P<0.01）,均具有统计学意义。2.在MCAO模型中,与Control组相比,L13治疗组三个剂量（5mg/kg、10mg/kg和15mg/kg）均能减少脑梗塞体积（P<0.001）。同时,L13治疗组脑梗塞半球伊文思蓝外渗在48h后明显减少（P<0.001）。MCAO后48h的神经功能检查显示,L13治疗组神经功能废损情况明显减轻（P<0.01）。通过Western blot,与Sham组相比,Control组血脑屏障相关蛋白的表达显著降低（ZO-1:P<0.05;Claudin-5:P<0.01;Collagen IV:P<0.01）;与Control组相比,L13治疗组中血脑屏障相关蛋白的表达显著增加（ZO-1:P<0.05;Claudin-5:P<0.05;Collagen IV:P<0.01）,但Laminin蛋白在脑梗塞24h后有所改善（P<0.05）,而Occludin蛋白未见明显变化。通过免疫荧光染色技术,与Sham组相比,Control组血脑屏障相关蛋白的表达显著降低（Claudin-5:P<0.05）;与Control组相比,L13治疗组中血脑屏障相关蛋白的表达显著增加（ZO-1:P<0.01;Claudin-5:P<0.05;Laminin:P<0.05）,均具有统计学意义。3.通过明胶酶谱法和原位酶谱法,在ICH模型中,与Control组相比,L13组血肿周围组织中MMP-9蛋白活性显著降低（P<0.05）;在MCAO模型中,与Control组相比,L13组MMP-9蛋白活性在脑梗塞核心区及外周均有明显下降（P<0.05）,L13组梗死脑组织中MMP-9蛋白活性显著降低（P<0.05）;4.在脑出血/脑梗塞患者血清中,通过Western blot,与健康志愿者相比,脑出血患者血清中MMP-9蛋白的表达量显著升高（P<0.01）,脑梗塞患者血清中MMP-9蛋白的含量稍有升高。通过明胶酶谱法,与用药前相比,L13共孵育组的患者血清中MMP-9活性显著降低（P<0.05）。结论L13通过抑制急性脑卒中后损伤脑组织内MMP-9的活性,减少其对BBB中基膜和紧密连接蛋白的降解,从而减轻BBB的破坏,最终改善急性脑卒中后的神经功能损伤。同时与急性脑卒中患者血清作用后,能显著降低血清中MMP-9活性,为药物的临床转化奠定基础。