研究背景和目的结直肠癌是当今最常见的疾病之一,全球每年有约120万名患者被确诊为结直肠癌,而有超过60万名患者的直接或间接死因是结直肠癌。结直肠癌的疾病分期是最重要的预后因素,I期患者的5年生存率可达90%以上,而Ⅳ期患者只有略大于10%的生存率，转移是影响结直肠癌患者疗效和死亡的主要原因,因此阐明结直肠癌发生转移的分子机制,对于降低死亡率和提高治愈率具有重大的科学意义。FMNL2是本课题组前期筛选出来的在结直肠癌细胞株和组织中表达上调的基因,它与结直肠癌发生淋巴结转移相关,并促进结直肠癌细胞的运动、侵袭和转移。此外,课题组对FMNL2调控结直肠癌侵袭和转移的分子机制进行了探讨,结果显示：FMNL2能通过诱导上皮-间质转化促进结直肠癌细胞发生转移,HMGA1/miR-137/FMNL2轴也参与结直肠癌侵袭和转移。在前期,我们利用酵母双杂交筛选FMNL2相互作用蛋白,其中COMMD10蛋白的结合的特异性较强。COMMD10是COMMD蛋白家族中的一员,COMMD蛋白是最近发现的一个蛋白家族,其特征是具有一个COMMD结构域。COMMD蛋白参与调控多种生物学过程如铜和钠运输、细胞增殖及对缺氧的适应等。目前有关COMMD家族与肿瘤的研究报道较少,仅有6篇文献。研究发现COMMD1常在人类癌症中表达下调,COMMD1的表达下调能促进肿瘤细胞的侵袭和转移；此外COMMD1能抑制转录因子NF-κB的活性。COMMD5在胶质母细胞瘤、肾细胞癌、肝细胞癌细胞株及组织中的表达明显下调,该基因可能参与肿瘤的细胞周期调控,COMM5转染人胚胎肾HEK293细胞后,细胞的增殖能力下降,细胞周期出现G2/M期阻滞,并伴有p21cipl/WhFl表达下调及p27KIPI下调。Gkiafi等利用比较蛋白组学方法筛选出7个COMMD蛋白是BL41Burkitt’s淋巴瘤细胞株中EB病毒作用的靶点。凝集素通过与SCF-βTrCP E3连接酶相互作用,促进COMMD1和IκB蛋白降解,从而增强前列腺癌细胞的NF-κB活性。目前尚未有COMMD10与肿瘤的研究报道。本研究对FMNL2相互作用蛋白COMMD10进行验证,明确COMMD10在FMNL2调控结直肠癌侵袭和转移中的作用,并进一步探讨了FMNL2通过COMMD10调控NF-kB通路的分子机制,旨在揭示FMNL2参与结直肠癌转移的新机制,为临床肿瘤转移干预及药物研制提供潜在治疗新靶点。研究方法1. FMNL2与COMMD10相互作用鉴定(1)利用免疫共沉淀(Co-IP)及荧光共聚焦检测FMNL2和COMMD10抗体的结合情况；(2)构建GST-COMMDIO截短子原核表达载体,利用GST-pull down实验和CO-IP实验明确FMNL2 (FLAG-FMNL2截短子真核表达载体前期由本课题组乔玉丹博士构建完成)与COMMD10相互作用结构域。(3)收集SW480/FMNL2、SW620/siFMNL2细胞的RNA和蛋白,利用荧光定量PCR及Western blot检测COMMD10表达量的变化；利用阳离子脂质体法将COMMD10过表达载体瞬时转染至SW480、SW620细胞株中,siCOMMD10干扰片段瞬时转染至SW480、HT29中,收集这四株细胞株的RNA和蛋白,利用荧光定量PCR及Western blot检测FMNL2表达量的变化。2. COMMD10抑制结直肠癌细胞的侵袭和转移(1)利用荧光定量PCR及Western blot在6株结直肠癌细胞株中筛选出COMMD10内源性表达量最高、最低及居中的3株结直肠癌细胞株。(2)构建pEGFP-C1-COMMD10过表达载体,利用阳离子脂质体法转染至结直肠癌细胞株SW480及SW620细胞中,利用荧光定量PCR以及Western blot鉴定转染效率。(3)利用阳离子脂质体法,将3个商品化的siCOMMD10片段瞬时转染至结直肠癌细胞株SW480及HT29中,利用荧光定量PCR及Western blot鉴定干扰效率。设计并构建COMMD10慢病毒干扰载体,由公司进行慢病毒上清的包装,并感染至结直肠癌细胞株SW480、HT29中,应用流式分选技术筛选稳转细胞株,利用荧光定量PCR及Western blot技术验证稳定株中COMMD10的干扰效率。(4)利用CCK8、Boyden小室侵袭实验、平板克隆形成实验、细胞周期、细胞凋亡检测COMMD10过表达和干扰后对结直肠癌细胞株体外生物学行为的影响。(5)利用SPF级BALB/c裸鼠动物模型,观察COMMD10干扰后对裸鼠皮下成瘤及尾静脉体内转移能力的影响。(6)收集31对新鲜结直肠癌组织及癌旁组织,利用实时荧光定量PCR检测COMMD10的表达情况,并随机选取其中10对配对组织进行Western Blot检测COMMD10在癌组织和癌旁组织中的表达情况。(7)免疫组化检测120例结直肠癌患者的石蜡切片中COMMD10的表达情况,并分析其与临床病理联系。3. FMNL2通过COMMD10调控[NF-κB信号通路,从而促进结直肠癌侵袭和转移(1)利用双荧光素酶报告系统检测COMMD10对NF-κB转录活性的影响。(2)利用Western blot检测COMMMD10对NF-κB通路的影响。(3) Western blot检测FMNL2通过COMMD10对NF-κB信号通路的影响。(4)构建FMNL2/COMMD10共表达和共干扰的细胞株,通过CCK8实验、Boyden小室侵袭实验、裸鼠皮下成瘤和体内转移实验观察COMMD10对FMNL2在结直肠癌中生物学行为的逆转作用。研究结果1.FMNL2-与COMMD10相互作用研究(1)利用CO-IP实验检测SW480、HCT116细胞中FMNL2与COMMD10结合情况,结果显示：FMNL2与COMMD10存在直接结合作用。(2)利用激光共聚焦显微镜观察SW480、HCT116细胞中FMNL2与COMMD10共定位情况,结果显示：FMNL2与COMMD10共定位于细胞胞浆中。(3)成功构建了COMMD10截短子原核表达载体：pGEX-6p-1-COMMD10 (1-132a)、pGEX-6p-1-COMMD10 (133-202a);成功表达了GST融合蛋白：GST-COMMD10 (1-132a)、GST-COMMD10 (133-202a)。GST-pull down结果显示,COMMD10 (1-132a)能与FMNL2直接结合：CO-IP实验结果显示：FMNL2 (525-616a)与COMMD10直接结合。(4)收集FMNL2或COMMD10过表达和干扰细胞株RNA和蛋白,荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,SW480/FMNL2细胞株中COMMD10的表达量明显下调(t=29.358, p<0.001); SW480/siFMNL2、SW620/siFMNL2细胞株中COMMD10的表达量明显高于对照组(t=-8.436, p<0.05; t=-5.511,p< 0.05); Western blot结果与Q-PCR结果一致,说明FMNL2可以负向调控COMMD10的表达。在SW480/COMMD10、SW620/COMMD10细胞株中FMNL2的表达量与对照组相比无显著统计学差异(t=-0.338, p>0.05; t=2.366, p> 0.05);在SW480/siCOMMD10. HT29/siCOMMD10细胞中FMNL2的表达量与对照组相比无显著统计学差异(t=-1.517, p>0.05; t= 0.547, p>0.05); Western blot结果与Q-PCR结果一致,说明COMMD10不能调控FMNL2的表达。2. COMMD10抑制结直肠癌细胞的侵袭和转移2.1COMMD10在结直肠癌中生物学特性的研究2.1.1 COMMD10在结直肠癌细胞中的表达验证(1) Western blot和real-time-PCR结果显示,COMMD10的表达在6种结直肠癌细胞株间的表达具有显著差异(F=131.316,p<0.001); COMMD10在HT29细胞中的表达最高,且显著高于LS174T、SW480、HCT116、 SW620、 LoVo细胞中的表达(p<0.001,p<0.001,p<0.001,p<0.001); COMMD10在SW620细胞中的表达最低,且明显低于HT2、LS174T、SW480、HCT116细胞中的表达(p<0.001, p<0.001, p<0.001, p<0.001);(2)利用阳离子脂质体法,将COMMD10质粒转染至结直肠癌细胞株SW480及SW620细胞中,荧光定量PCR及Western blot检测发现：以各自细胞MOCK组为对照,独立样本T检验分析显示,过表达组COMMD10的表达量明显增加(t=-4.756, p=0.017; t=-466.661, p=0.015).(3)将siCOMMD10瞬时转染至HT29、SW480细胞中,荧光定量PCR和Western blot检测COMMD10的表达。Q-PCR结果显示,COMMD10-siRNA-1/-2/-3瞬时转染至细胞后COMMD10-mRNA水平显著降低(p<0.001, p<0.001,p<0.001, p<0.001, p<0.001, p<0.001), Western blot结果与Q-PCR结果一致,si-1/-2/-3均为有效干扰序列,且干扰效率间无明显差异(p>0.05, p>0.05, p>0.05,p>0.05, p>0.05, p>0.05)。选择sil构建SW480/siCOMMD10、HT29/siCOMMD10稳定株,利用荧光定量PCR和Western blot检测COMMD10的表达,独立样本T检验分析显示,与NC组相比,干扰组中COMMD10-mRNA表达明显降低(t=10.457, p<0.001;t=9.198, p<0.001)。2.1.2 COMMD10结直肠癌细胞体外生物学行为的影响(1)利用CCK8实验观察COMMD10过表达或者干扰对细胞体外增殖能力的影响,同时绘制生长曲线。析因方差分析结果显示：在过表达组,SW480、 SW620细胞生长时间水平具有显著差异性(F=304.467, p<0.001; F= 1874.713,p<0.001),细胞增殖能力组间具有显著差异性(F=133.700,p<0.001;F= 753.713, p<0.001),时间与分组之间的交互效应显著性(F=24.504,p<0.001; F= 102.071,p<0.001);在干扰组中,SW480、HT29细胞生长时间水平具有显著差异性(F=612.674, p<0.001; F= 505.402,p<0.001),细胞增殖能力组间具有显著差异性(F=110.541,p<0.001; F= 966.668,p<0.001),时间与分组之间的交互效应显著性(F= 15.385,p<0.001; F= 71.803,p<0.001)。结果表明,与MOCK组相比,COMMD10过表达组的增殖速度明显减慢：与NC组相比,COMMD10干扰组增殖速度明显增加。(2)利用平板克隆形成实验观察SW480/NC和SW480/siCOMMD10细胞体外增殖能力的变化,两独立样本T检验统计结果显示,与NC组相比,COMMD10干扰组的增殖能力明显增加(t=-10.124,p<0.001)。(3)用流式细胞仪检测COMMD10对细胞周期的影响,独立样本T检验结果显示：SW480/COMMD10组与SW480/MOCK组相比,G1期的细胞比例明显增加(t=-20.145,p<0.001)；S期的细胞比例明显减少(t=11.248,p<0.001)；G2/M期的细胞比例明显增加(t=4.794, P=0.009); SW480/siCOMMD10组与SW480/NC组相比,G1期的细胞比例明显减少(t-7.303,p=0.002)；S期的细胞比例明显增加(t=-4.003, p=0.016);G2/M期的细胞比例明显减少(t=-4.825,p＝0.035)；提示COMMD10能抑制癌细胞从G1向S期演进,从而抑制细胞增殖能力。(4)利用流式细胞仪检测COMMD10对细胞凋亡的影响,独立样本T检验结果显示：过表达COMMD10后,发生早期凋亡的细胞数目明显增加(t=-7.821,p=0.013)；干扰COMMD10后,发生早期凋亡的细胞数目明显减少(t=7.917,p=0.001),说明COMMD10能促进结肠癌细胞凋亡。(5)利用Boyden小室观察COMMD10过表达或者干扰后,结直肠癌细胞的体外侵袭能力的变化。两独立样本T检验分析结果显示,与MOCK组相比,SW620/COMMD10组与SW480/COMMD10细胞穿过膜的细胞数目明显减少(t=8.944, p<0.001;t=5.785, p<0.001),与NC组相比,SW480/siCOMMD10与HT29/siCOMMD10组穿过膜的细胞数目明显增多(t=-7.019,p<0.001; t=-9.477, p<0.001),表明COMMD10抑制肿瘤细胞的体外侵袭能力。2.1.3 COMMD10结直肠癌细胞体内生物学行为的影响利用SW480/NC、SW480/siCOMMD10细胞株进行裸鼠皮下成瘤和尾静脉注射体内转移实验。皮下肿瘤经两独立样本T检验,结果显示：COMMD10干扰组的皮下肿瘤重量明显高于NC组(t=-7.166,p<0.001)。裸鼠的尾静脉体内转移实验结果显示：两组细胞均在肺脏表面可见明显的转移灶,SW480/NC组中裸鼠出现肺脏转移率为80%(4/5)；SW480/SiCOMMD10组中裸鼠出现肺脏转移率为100%(5/5)。以上结果显示：COMMD10抑制结直肠癌细胞株的体内成瘤及转移能力。2.1.4 COMMD10在结直肠癌中的表达及与临床病理联系(1)利用实时荧光定量PCR检测了31对新鲜结直肠癌组织及远端正常组织COMMD10的表达,结果显示COMMD10在结直肠癌组织中的表达明显低于正常粘膜组织(t=5.226,p<0.001)；随机选取其中10对配对组织进行Western Blot检测发现COMMD10在癌组织中的表达明显低于癌旁组织。(2)免疫组化检测120例结直肠癌病人的石蜡切片中COMMD10的表达情况,临床病理分析结果显示：COMMD10与患者年龄、肿瘤、分化程度、浸润深度、肿瘤的大小以及肿瘤Dukes分期均无显著关系(p>0.05, p>0.05, p >0.05, p>0.05, p>0.05);与有无淋巴结转移和远处转移上存在统计学差异(p=0.013,p=0.014)。3.FMNL2通过COMMD10调控NF-κB信号通路,从而促进结直肠癌细胞侵袭和转移3.1COMMD10抑制NF-κB信号通路激活(1)以商品化NF-κB为荧光素酶报告系统表达载体,利用荧光素酶报告系统检测COMM10对NF-κB转录活性的影响。结果显示：在SW480细胞中,以MOCK组为对照,COMMD10组荧光素酶活性显著降低(p<0.05,p<0.05),加入TNF-α处理后,荧光素酶活性明显增加(p<0.001,p<0.05)；与单纯加入TNF-α处理组相比,同时转染了COMMD10和加入TNF-α处理后,荧光素酶活性显著下降(p<0.001,p<0.05)；以NC组为对照,siCOMMD10组荧光素酶活性显著增加(p<0.001,p<0.001),siCOMMD10组与同时转染了siCOMMD10和κλBα-mut组(IκBα的负性突变体,为NF-κB信号通路的抑制剂)相比,荧光素酶活性明显下降(p<0.001；p<0.001)说明COMMD10能够抑制NF-κB的转录活性。(2) Western blot检测NF-κB信号通路蛋白的表达变化,结果显示：在SW480细胞中,以MOCK组为对照,加入TNF-α刺激后,p-IKKα/β、p-IκBα、细胞核内p65表达上调；IKKα/β、IκBα、胞浆内p65表达下调,而加入TNF-α刺激的同时过表达COMMD10发现p-IKKα/β、p-IκBα、细胞核内p65表达出现下调,IKKα/β、IκBα、胞浆内p65表达上调。在SW480细胞中,以NC组为对照,干扰COMMD10后p-IKKα/β、p-IκBα、细胞核内p65表达上调,IKKα/β、IκBα、胞浆内p65表达下调,而干扰COMMD10的同时加入IκBα-mut后,p-IKKα/β、 p-IκBα、细胞核内p65表达出现下调,IKKα/β、IκBα、胞浆内p65表达上调。以上结果说明COMMD10能够抑制NF-κB信号通路的激活。3.2 FMNL2通过COMMD10影响NF-κB信号通路激活利用Western blot检测SW480/MOCK、SW480/FMNL2、 SW480/FMNL2/COMMD10细胞和SW620/NC、SW620/siFMNL2、 SW620siFMNL2/siCOMMD10细胞中NF-κB信号通路蛋白表达变化,结果显示：SW480/FMNL2与SW480/MOCK相比,SW480/FMNL2细胞中p-IKKα/β、 p-IκBα、细胞核内p65表达上调,IKKα/β、IκBα、胞浆内p65表达下调；SW480/FMNL2/COMMD10与SW480/FMNL2相比,SW480/FMNL2/COMMD10细胞中p-IKKα/β、p-IκBα、细胞核内p65表达下调,IKKα/β、 IκBα、胞浆内p65表达上调；说明FMNL2通过COMMD10影响NF-κB信号通路激活。3.3 FMNL通过COMMD10调控结直肠癌侵袭和转移(1)CCK8实验结果显示：以SW480/MOCK为对照,SW480/FMNL2的体外增殖速度明显增加(p<0.001); SW480/FMNL2/COMMD10与SW480/FMNL2相比,S W480/FMNL2/COMMD10体外增殖速度明显下降(p<0.001)；在SW620细胞中,以NC组为对照,siFMNL2组的增殖速度明显下降(p<0.001),而siFMNL2/siCOMMD10组能有效逆转这种抑制作用(p<0.001)。说明COMMD10能够抑带FMNL2的体外促细胞增殖能力。(2) Boy den小室侵袭实验结果显示：在SW480细胞株中,与MOCK组对比,FMNL2组侵袭到下室的细胞数目明显增多(p<0.001),表明FMNL2能促进细胞侵袭能力,而FMNL2/COMMD10组能有效减弱了FMNL2的促侵袭能力(p<0.001)；在SW620细胞株中,以NC组为对照,干扰FMNL2组细胞侵袭能力明显下降0<0.001),而siFMNL2/siCOMMD10组能有效逆转了干扰FMNL2的抑制作用(p<0.05)。结果表明,COMMD10能够抑制FMNL2的体外促细胞侵袭能力。(3)裸鼠皮下成瘤实验显示：与NC组相比,siFMNL2组皮下肿瘤重量明显减少(p<0.05), siFMNL2/siCOMMD10组能有效减弱siFMNL2对皮下成瘤的抑制作用(p<0.05)：以上结果表明COMMD10能够抑制FMNL2的体内促肿瘤生长能力。(4)体内肺转移实验显示,与NC组相比,siFMNL2组转移至肺的肿瘤结节明显减少(p<0.05),siFMNL2/siCOMMD10组能有效逆转siFMNL2对肺转移的抑制作用(p<0.05)；以上结果表明COMMD10能够抑制FMNL2的体内促肺转移能力。结论1. FMNL2 (525-616a)结构域与COMMD10 (1-132a)结构域直接结合；2. COMMD10在结直肠癌组织中表达下调,并抑制结直肠癌细胞的侵袭及转移能力；3.F-NL2通过COMMD10影响NF-κB信号通路活化,从而促进结直肠癌侵袭和转移。