第一部分基于生物信息学方法对CELSR家族在肺腺癌中作用进行系统性分析目的:基于生物信息学方法分析筛选出CELSR3在肺腺癌中的价值方法:1.Oncomine数据库是目前世界上最大的在线癌基因芯片数据库和整合数据挖掘平台,可以进行差异表达分析、共表达分析,旨在全面挖掘癌症基因组信息。我们利用Oncomine数据库分析了肺癌组织和正常组织中CELSRs mRNA的表达水平,并对所有肺癌组织中CELSRs的转录水平进行统计比较。我们设置的阈值:P<0.05,fold change>1.5,基因排名在前10%。2.UALCAN是一个交互式网络资源癌基因数据库,它提供了全面的癌症转录组数据,用于深入分析TCGA中存储的31种癌症基因表达水平和临床数据。我本研究通过该数据库分析了肺癌组织和正常组织以及不同肺腺癌亚组中CELSR3 mRNA的相对表达水平。3.GEPIA是一个基于TCGA和GTEx项目的基因表达数据交互式分析网站,可提供基因差异表达分析、基于基因表达的生存分析、表达相似分析、基因表达相关性和主成分分析。本研究利用该数据库分析TCGA中CELSR3和其他目标基因表达的相关性,采用Spearman方法确定两个基因表达之间的相关性大小。4.Kaplan-Meier Plotter数据库是一个基于GEO、EGA以及TCGA等公共数据库的基因芯片和RNA-seq数据构建而成,评估了54675个基因在21种癌症中对于生存率的影响,包括乳腺癌、卵巢癌、肺癌和胃癌。本研究利用该数据库分析了肺腺癌患者的总生存期（OS）和首次进展期（FP）。根据患者样本中CELSRs的中位表达值分为高表达组和低表达组,（P<0.05,FDR<0.05）,风险比（HR）95%的置信区间。5.Linked Omics数据库是一个用于分析32种TCGA癌症相关数据集的综合分析网站。本研究使用Linked Omics的Link Finder模块研究TCGA肺腺癌中与CELSR3 mRNA表达相关的差异基因。结果用Pearson相关系数进行统计分析,用Link Finder建立单个基因的表达统计图。本研究使用基于web的基因集分析工具包（Web Gestalt）进行功能富集分析。对Link Finder结果中的数据进行签名和测序,使用GSEA分析基因本体（GO）分析、KEGG分析和网络分析（包括miRNA-target富集、激酶-target富集和转录因子-target富集）。利用分子特征数据库（MSig DB）对网络进行分析（FDR<0.05）。6.TIMER数据库是一个系统分析32种肿瘤类型免疫浸润的综合资源网站。本研究通过基于基因分析模式,分析了CELSR3在不同类型肺癌中的表达,以及与各种免疫细胞浸润（包括B细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞）的相关性。此外,通过相关模块探讨TIICs中CELSR3表达及与其遗传标记的相关性。7.TISIDB是一个结合了来自2530份出版物和988个与抗肿瘤免疫相关基因的4176项记录和报告的门户网站。本研究通过分析TISIDB数据库,探索CELSR3的功能及其在肿瘤免疫相互作用中的作用。X轴以CELSR3作为基因符号,Y轴以TIICs相关基因标记作为基因符号。采用Log2RSEM测定来显示基因表达量。结果:1.与正常肺组织相比,肺腺癌中CELSR3 mRNA的表达更高。2.CELSR3 mRNA表达在肺腺癌性别、年龄、N分期、M分期、T分期亚组分析中均具有统计学意义。3.CELSR3 mRNA高表达的肺腺癌患者预后较差。4.肺腺癌中与CELSR3共表达的基因进行GO和KEGG通路分析显示,CELSR3与细胞周期、DNA复制、细胞黏附等机制相关。5.肺腺癌中与CELSR3相关的激酶包括ATM、PLK、CDK1、CDK2、CHEK1和CHEK2;相关的miRNAs包括MIR-517、MIR-503、MIR-370、MIR-331、MIR-197、MIR-125和MIR-412;相关的转录因子为E2F1和E2F4。6.肺腺癌中CELSR3 mRNA表达与CD8+T细胞浸润相关。7.CELSR3导致CD8+T细胞浸润不同可能与CCL17/CCR4轴相关。小结:1.CELSR3 mRNA在肺腺癌中高表达且预后不良。2.CELSR3 mRNA表达在肺腺癌性别、年龄、N分期、M分期、T分期亚组分析均有统计学意义。3.CELSR3 mRNA的表达与细胞周期、增殖、侵袭相关。4.肺腺癌中CELSR3 mRNA表达与CD8+T细胞浸润相关,可能是经CCL17/CCR4趋化因子受体轴介导。第二部分CELSR3敲降对肺腺癌细胞增殖的影响及其机制研究目的:探讨CELSR3对肺腺癌细胞增殖的影响及其作用机制。方法:1.测定肺腺癌的肿瘤组织及非肿瘤组织中CELSR3的表达水平。2.利用Western blot技术检测肺腺癌A549和H1975细胞中CELSR3的表达水平。3.设计并合成si-CELSR3及空白对照NC,将其转染进入A549和H1975细胞中;q RT-PCR方法检测A549和H1975细胞中CELSR3的表达情况。4.利用CCK-8法检测转染si-CELSR3及NC对肺腺癌A549和H1975细胞增殖能力的影响。5.流式细胞术（flow cytometry,FCM）检测转染si-CELSR3及对照NC对肺腺癌A549和H1975细胞凋亡水平的影响。6.流式细胞术（flow cytometry,FCM）检测转染si-CELSR3及对照NC对肺腺癌A549和H1975细胞细胞周期的影响。7.克隆形成实验（Colony Formation Assays）检测转染si-CELSR3及对照NC对肺腺癌A549和H1975细胞增殖能力的影响。8.利用Western blot技术检测转染si-CELSR3及对照NC对肺腺癌A549和H1975细胞中Caspase-3和Caspase-8蛋白表达的影响。结果:1.免疫组化方法显示了肺腺癌组织及非肿瘤组织中CELSR3的表达水平,癌组织中CELSR3蛋白表达水较正常组织升高。2.利用Western blot方法检测了2种肺腺癌细胞株中CELSR3蛋白的表达水平,A549和H1975细胞中CELSR3蛋白表达水平较高,因此在后续研究中,可以干扰A549和H1975细胞中CELSR3的表达,从而作为研究对象。3.转染不同的CELSR3 siRNA后,q RT-PCR分析显示A549和H1975的CELSR3 mRNA表达均降低,效果相对好的是siRNA#1。4.细胞增殖相关实验显示,与对照组相比,CELSR3敲低的A549和H1975细胞增殖能力明显下降（P<0.05）。5.流式细胞术结果显示,与对照组相比,CELSR3敲低的A549和H1975细胞凋亡水平明显增加（P<0.05）。6.Western blot技术检测结果显示,肺腺癌A549细胞中Caspase-3和Caspase-8蛋白表达水平明显降低（P<0.05）。小结:1.转染si-CELSR3能有效降低CELSR3表达水平。2.干扰CELSR3的表达能够显著抑制A549和H1975细胞的增殖和克隆形成能力,可以促进A549和H1975细胞的凋亡。3.抑制Caspase-3和Caspase-8的蛋白表达可能是CELSR3调控肺腺癌细胞凋亡的机制。第三部分CELSR3敲低对肺腺癌细胞的迁移和侵袭的影响及其机制研究目的:探讨CELSR3对肺腺癌细胞的迁移和侵袭的影响及其可能作用机制。方法:1.将si-CELSR3及对照NC转染A549和H1975细胞;利用细胞划痕实验检测CELSR3敲低对肺腺癌A549和H1975细胞迁移能力的影响。2.Transwell小室迁移实验检测CELSR3敲低对肺腺癌A549和H1975细胞迁移能力的影响。3.Transwell小室侵袭实验检测CELSR3敲低对肺腺癌A549和H1975细胞侵袭能力的影响。4.利用Western blot技术检测CELSR3敲低对肺腺癌A549和H1975细胞中E-cadherin和Vimentin蛋白表达的影响。结果:1.细胞划痕实验和Transwell小室迁移实验结果均表明,与对照组相比,CELSR3敲低的肺腺癌A549和H1975细胞迁移能力明显下降（P<0.05）。2.Transwell小室侵袭实验结果表明,与对照组相比,CELSR3敲低的肺腺癌A549和H1975细胞侵袭能力明显下降（P<0.05）。3.Western blot技术检测结果表明,CELSR3敲低的肺腺癌A549和H1975细胞中E-cadherin蛋白表达升高（P<0.05）,Vimentin蛋白表达降低（P<0.05）。小结:1.干扰CELSR3的表达能够显著抑制肺腺癌A549和H1975细胞的迁移和侵袭能力。2.CELSR3可能通过调控EMT途径从而介导肺腺癌细胞的迁移和侵袭能力。