乳酰-N-新四糖（Lacto-N-neotetraose,LNnT）是母乳中含量较高的母乳寡糖之一,可以作为食品添加剂加入到婴儿配方奶粉中,具有增强人体免疫力、降低疾病侵染几率、提高肠道功能等作用,应用前景良好。微生物发酵法是合成LNnT的常用方法之一,但其存在着底物转化率低、代谢途径复杂不利于产物合成等问题。因此,本研究利用重组大肠杆菌（Escherichia coli）对发酵合成LNnT的代谢途径和关键酶的表达进行调控,从而提高LNnT的合成效率。首先,选择野生菌株E.coli K12 MG1655作为出发菌株,构建LNnT的从头合成途径。将来源于脑膜炎奈瑟菌（Nesseria meningitides）的编码β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶的lgtA基因和编码β-1,4-半乳糖基转移酶的lgtB基因克隆至表达载体pCDFDuet-1上,得到重组质粒pCDFDuet-lgtAB。然后,将重组质粒转化到原始菌株中进行表达,验证异源基因表达成功,通过摇瓶发酵验证,LNnT的初始产量为0.04 g/L,表明LNnT的从头合成途径构建成功。乳糖是合成LNnT的重要底物,为了提高底物乳糖的转化率,将分解乳糖的lacZ基因（编码β-半乳糖苷酶）敲除,并过表达控制乳糖进出细胞的lacY基因（编码β-半乳糖苷通透酶）,得到的重组菌株M0-PAB的LNnT产量为0.41 g/L,LNnT对乳糖的得率从0.01 mol/mol提高至0.09 mol/mol。此外,乳酰-N-三糖（Lacto-N-triose II,LNTII）是合成LNnT的重要中间产物,代谢途径中关键限速酶的表达量的变化,会影响LNTII的积累量,从而影响产物LNnT的产量。通过CRISPR-Cas9和CRISPRi基因编辑技术确定代谢途径中的关键限速酶,并对编码关键限速酶的基因pgi、glmS、glmM、glmU、manA、murA、wecB、nagB的表达进行组合优化,得到了LNTII积累量较高的菌株,利用改造后的菌株发酵合成LNnT,产量最高达到了1.04 g/L。最后,对前体UDP-半乳糖（UDP-glucose,UDP-Gal）代谢途径中编码关键酶的基因pgm、gal E、ugd的表达进行调控,得到产量最高的菌株M29AB,LNnT的产量达到1.2g/L,比对照菌株M0-PAB的产量提高了93%,LNnT对乳糖的产率达到0.28 mol/mol。并对发酵条件进行优化,得到了最优发酵条件:底物乳糖浓度5 g/L,发酵温度30℃,发酵时间60 h。