论文部分内容阅读
胶质母细胞瘤(Glioblastoma,GBM)是脑肿瘤中恶性程度高、预后较差的恶性肿瘤,其中位生存期平均仅有14.6个月,目前的治疗手段主要是手术切除合并术前、术后的放化疗,以提高病人的生存期。由于胶质母细胞瘤的侵袭性强,边界不清,手术切除后复发率较高,加上放疗抵抗与化疗抵抗的现象使得胶质母细胞瘤的治疗越发困难,寻求有效的靶向治疗成为了胶质瘤研究领域的新思路。胶质母细胞瘤中常见表皮生长因子受体的扩增和突变。表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR)及其第三种突变体 EGFRvⅢ的扩增与过表达可加剧胶质母细胞瘤的致瘤性。EGFRvⅢ不需要通过与配体表皮生长因子结合即可形成二聚体持续自磷酸化,激活下游信号通路完成信号转到从而促进胶质母细胞瘤的增殖与侵袭。适配子是通过SELEX技术筛选而来的单链寡核苷酸,因与其靶标具有高亲和力、高特异性越来越受到研究者的重视。金纳米颗粒因具备良好的光电性能已逐渐在纳米递药系统中广泛研究。本课题的主要目的是探究适配子U2对胶质母细胞瘤的放射增敏作用机制及将其联合金纳米颗粒后对胶质母细胞瘤体外的抑瘤作用的初步研究。在本课题研究中,我们首先通过流式细胞术验证了本课题组前期通过Cell-SELEX技术筛选得到的适配子U2对过表达EGFRvⅢ的U87MG细胞即U87-EGFRvⅢ细胞的特异性,利用细胞免疫染色的方法探究适配子U2进入U87-EGFRvⅢ细胞的机制,并通过蛋白免疫印迹的方法研究适配子对U87-EGFRvⅢ细胞产生抑制增殖、迁移和侵袭作用的分子机制;然后通过联合X-射线研究适配子U2能否起到放射增敏的作用,利用克隆形成实验与彗星实验对U2放射增敏效果进行检测,利用蛋白免疫印迹的方法探究放射增敏的分子机制;最后将适配子U2与粒径为15nm的金纳米球形颗粒连接后通过紫外-可见分光光度计、透射电镜、动态光散射仪和琼脂糖凝胶电泳检测是否将适配子U2与金纳米颗粒成功连接,然后检测其体外抑瘤的初步作用。通过将多种胶质瘤细胞系与FAM标记的适配子进行孵育后通过流式细胞仪进行计数,发现FAM-U2与FAM-Scr1的结合率均低于5%,而FAM-U2与U87-EGFRvⅢ细胞结合率高达95%;通过激光共聚焦荧光显微镜可检测到U2可进入U87-EGFRvⅢ细胞内,并发现U2-EGFRvⅢ-初级内体三者在胞内发生共标;通过Western Blot检测可知U2处理U87-EGFRvⅢ细胞6h后可显著降低EGFRvⅢ蛋白的磷酸化水平而不改变其总蛋白的水平,与此同时并未检测到PDGFR β的高表达;U2处理后可检测到EGFRvⅢ蛋白下游的MET和ERK蛋白的磷酸化水平也发生显著降低。在放射敏感性研究中表明,U2联合X射线处理后可明显降低U87-EGFRvⅢ细胞的克隆形成率,增加DNA片段的产生,在彗星实验中表现为彗尾拖长,尾部DNA含量、尾矩和Olive矩增加;通过Western Blot技术检测U2联合X射线处理后可抑制DNA损伤修复信号分子pH2A.X,ATM,Chk2的磷酸化水平及53BP1的总蛋白水平;与此同时EGFRvⅢ蛋白水平其磷酸化水平在U2联合X射线放射处理后亦发生显著性降低。在适配子U2联合金纳米的研究中可观察到,通过适配子修饰后可提高金纳米颗粒在盐溶液中的稳定性;通过透射电镜、动态光散射仪、紫外-可见分光光度计和水平琼脂糖凝胶电泳等方法验证后可知金纳米颗粒成功与适配子连接,金纳米颗粒的最大吸收峰发生红移。通过EdU染色法检测U87-EGFRvⅢ细胞的增殖能力可知,适配子U2-金纳米复合物能对靶细胞的增殖能力发挥显著地抑制作用。结果表明:适配子U2是通过抑制EGFRvⅢ蛋白的磷酸化水平进而抑制其下游信号通路从而影响U87-EGFRvⅢ细胞的增殖迁移侵袭和凋亡;适配子U2联合X-射线可作为放疗增敏剂应用于临床;金纳米-适配子复合物的制备可高效抑制U87-EGFRvⅢ细胞的生长,利于其在体内穿透血脑屏障更好地发挥抑瘤作用。