背景巨噬细胞是动脉粥样硬化(AS)发生发展中最主要的细胞类型,与脂质沉积及炎症密切相关。循环中单核细胞募集至内皮下是动脉粥样硬化发生的最早期事件。单核细胞分化为巨噬细胞,吞噬大量含载脂蛋白B(apoB)且富含胆固醇的脂蛋白颗粒。在动脉粥样硬化的早期阶段,大部分被吞噬的胆固醇以胆固醇-脂肪酸酯的形式储存,导致了巨噬细胞源性泡沫细胞的形成。当动脉粥样硬化病变进一步进展,出现胆固醇酯含量的逐步下降,以及相应的非酯化的游离胆固醇(free cholesterol, FC)含量的进行性增加。FC在细胞的大量蓄积,导致巨噬细胞凋亡和继发性坏死,继而引起病变坏死、斑块破裂、血栓形成,最终导致临床急性心血管事件发生。同时越来越多研究者发现,在FC诱导凋亡发生前所触发的炎症反应是影响斑块稳定性、造成动脉粥样硬化病变进展的另一重要因素。AS所致缺血性心脏疾病是中、老年人群发病和死亡的常见原因,探索能有效防治AS的措施一直是心血管疾病领域的研究热点。AS是一种多因素疾病,体内多种因子均不同作用地参与其发生发展,其中,载脂蛋白A-I(apoA-I)和载脂蛋白E(apoE)被认为是该疾病的两个保护性因子,二者均能通过多种途径拮抗AS,且相互存在协同效应。通过重组apoA-I和apoE全蛋白质(holoprotein)虽然能够治疗AS,但因二者均为大分子蛋白(分子量分别为28kD和34kD),故只能通过静脉给药,且制备不易、成本高昂,限制了其临床应用。因此,通过研制分子量更小而功能上相当的apoA-I模拟肽和apoE模拟肽用以治疗AS及其相关性疾病,被认为是防治AS方面很有前景的新策略,且已取得了较大进展。然而,现有apoA-I模拟肽和apoE模拟肽在抗AS方面均存在各自的不足,这在一定程度上降低了二者的治疗效应。于是有研究者利用天然apoA-I与apoE功能上的互补性,将apoE受体结合域与含有两性螺旋结构的apoA-I模拟肽共价结合,形成一种新型的具有双结构域的载脂蛋白嵌合模拟肽即Ac-hE-18A-NH2。研究发现这种双结构域的嵌合模拟肽可以促进成纤维细胞、HepG2细胞对低密度脂蛋白(LDL)的摄取、吸收和降解。进一步研究发现Ac-hE-18A-NH2模拟肽在体内具有抗炎及抗氧化的特性。在apoE基因敲除小鼠模型,静脉注射该模拟肽,血浆胆固醇水平明显下降。高胆固醇血症兔静脉注射Ac-hE-18A-NH2后,不仅显著降低了血浆胆固醇水平,而且通过降低血浆中过氧化氢脂质、增加高密度脂蛋白(HDL)对氧磷酶浓度、诱导超氧阴离子形成从而对抗氧化应激、改善内皮功能,从而起到抗动脉粥样硬化作用。目的观察载脂蛋白嵌合模拟肽Ac-hE-18A-NH2对氧化低密度脂蛋白(oxLDL)刺激下RAW 264.7巨噬细胞胆固醇流出、凋亡及炎症介质释放的影响,并探讨其可能的作用机制。方法RAW264.7巨噬细胞传代后接种于细胞培养板,分为三组：(1)胆固醇流出检测组：细胞种植于24孔板,用0.5μCi／孔3H-胆固醇和含50μg/ml oxLDL共同孵育24小时之后,给予不同浓度的Ac-hE-18A-NH2 (0-100μg/ml)干预24h,收集细胞用液体闪烁计数法检测胆固醇流出。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定细胞内环磷酸腺苷(cAMP)含量,采用实时荧光定量PCR及Western blot检测三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1),肝X受体α(LXRα)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)的mRNA及蛋白表达；(2)凋亡检测组：细胞种植于6孔板,50μg/ml oxLDL处理RAW264.7细胞48小时后加入不同浓度的模拟肽Ac-hE-18A-NH2(1、10、50、100μg/ml)和胆固醇流出促进剂β-环糊精(β-CD)或胆固醇流出阻断剂布雷菲得菌素(BFA)共同孵育24小时。Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒及流式细胞仪检测细胞凋亡；分别通过试剂盒检测caspase-3活性及细胞内胆固醇含量；Western-blot检测细胞bcl-2蛋白的表达；(3)炎症反应组：oxLDL刺激RAW264.7巨噬细胞,给予不同浓度的模拟肽Ac-hE-18A-NH2(1-100μg／ml)干预,收集细胞,测定TNF-α分泌和mRNA表达水平。Western-blot检测ABCA1及P-IκB蛋白浓度。EMSA检测核因子-κB (NF-κB)活性。结果1.模拟肽Ac-hE-18A-NH2以浓度依赖及时间依赖方式促进巨噬细胞内胆固醇流出。1、10、50、100μg/ml Ac-hE-18A-NH2干预24小时后,其介导的胆固醇流出率分别为12.04±1.65%、16.19±1.45%、26.93±4.37%和24.58±2.43%；50μg/ml Ac-hE-18A-NH2干预细胞不同时间,其介导的胆固醇流出率分别为10.86±1.46%(6h),13.43±1.55%(12h),20.58±1.34%(18h),和26.93±4.37%(24h)。2.Ac-hE-18A-NH2以浓度依赖方式增加细胞内cAMP水平,上调ABCA1、LXRα和PPARγmRNA和蛋白表达。3.加用cAMP刺激剂8-Br-cAMP, Ac-hE-18A-NH2介导的胆固醇流出率明显增加(26.93±4.37,35.81±2.73；P<0.05),ABCA1mRNA表达增加了66.67%。而加用PPARγ特异性抑制剂预处理细胞后,PPARγ的表达几乎完全抑制,ABCA1和LXRα的表达也受到一定程度抑制,Ac-hE-18A-NH2介导的胆固醇流出率明显减少(26.93±4.37,17.23±1.93；P<0.01)。4.OxLDL诱导的RAW264.7巨噬细胞的凋亡率随着oxLDL浓度的增加和处理时间的延长而显著提高。5.50μg/ml oxLDL处理细胞48小时后,加入不同浓度的模拟肽Ac-hE-18A-NH2 (1、10、50、100μg/ml)干预,细胞凋亡率以浓度依赖的方式逐渐减少。6.模拟肽Ac-hE-18A-NH2呈浓度依赖性的促进细胞内胆固醇流出和降低细胞内的胆固醇含量,降低caspase-3的活性,上调bcl-2的蛋白表达。7.β-CD与Ac-hE-18A-NH2共同作用后胆固醇流出明显增加,细胞凋亡率相应减少。而通过BFA部分阻断介导的胆固醇流出,细胞凋亡率明显增加。8.OxLDL刺激使RAW264.7巨噬细胞TNF-α分泌和mRNA表达明显增强,细胞内胆固醇蓄积,促进IκB磷酸化,并激活NF-κB。9.Ac-hE-18A-NH2浓度依赖性降低TNF-α分泌及mRNA表达,上调ABCA1 mRNA和蛋白的表达,减少细胞内胆固醇含量,抑制NF-κB活化,并抑制IκB磷酸化。相同的实验条件下及作用浓度,D-4F对于TNF-α分泌的抑制作用不如Ac-hE-18A-NH2。10.与oxLDL刺激组比较,50μg/ml Ac-hE-18A-NH2使上清TNF-α浓度降低56%,其mRNA表达降低67%,细胞内胆固醇含量降低65%,ABCA1 mRNA和蛋白表达均明显上调,NF-κB活性减少65.34%,胞浆中IκB-α蛋白水平明显升高,而p-IκB-α蛋白水平明显降低。结论1.模拟肽Ac-hE-18A-NH2可以明显促进巨噬细胞胆固醇流出,其机制可能与cAMP-ABCA1和PPARγ-LXRα-ABCA1两种途径有关。2.模拟肽Ac-hE-18A-NH2可以明显抑制oxLDL诱导的巨噬细胞胆固醇凋亡,其作用与促进细胞胆固醇流出、减少细胞内胆固醇蓄积有关。3.Ac-hE-18A-NH2能抑制oxLDL诱导的RAW264.7巨噬细胞TNF-α分泌和mRNA表达,FC-IκB/NF-KB-TNFα信号通路是其中作用途径之一。