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曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)是我国传统的头足类渔业资源,上世纪70年代以来由于过渡捕捞和环境条件的恶化,其资源量严重衰退。近年来,由于增殖放流、人工养殖等技术的推广,曼氏无针乌贼资源量得到了一定的恢复。然而养殖的曼氏无针乌贼容易性早熟,个体出现小型化。因此,阐明曼氏无针乌贼在人工养殖条件下生殖发育的神经内分泌调控机制势在必行。胰岛素样肽及其受体可以通过介导保守的胰岛素信号通路来调控无脊椎动物的生长、代谢、发育、生殖和衰老等。而有关胰岛素样肽及其受体在曼氏无针乌贼等头足类生殖发育中的调控作用及其机制仍未有确切的论述。本文中首次克隆了曼氏无针乌贼胰岛素样肽及其受体基因,并进行了序列分析、亚细胞定位、组织及生殖周期表达特征、生殖发育功能及相关信号通路等方面的初探。主要研究结果如下:应用RACE克隆技术得到一条全长为926 bp的胰岛素样肽基因(Sj ILP)cDNA序列(GenBank accession number MK611805),由可编码161个氨基酸的486 bp ORF区、310 bp 5’UTR和130 bp 3’UTR构成。经预测,SjILP具有与脊椎动物胰岛素前体相似的基因结构:信号肽、B链、C肽和A链,都含有保守的半胱氨酸残基以及两个C肽的切割位点。氨基酸序列同源性比对显示,Sj ILP与同为软体动物门头足纲的双斑蛸相似性最高,为39.02%。系统进化分析发现,Sj ILP与其他已确认的软体动物ILPs聚在一起。而胰岛素样肽受体基因(SjILPR)cDNA序列全长为5288 bp(GenBank accession number MK611806),由可编码1587个氨基酸的4764 bp ORF区、487 bp5’UTR和37 bp 3’UTR构成。Sj ILPR具有胰岛素受体家族的典型结构特征,存在4种结构域:受体L-结构域(L1和L2)、弗林蛋白酶样富含半胱氨酸的结构域(Cys)、Ⅲ型纤连蛋白结构域(Fn III)和蛋白激酶结构域(TK)。其中,“L1-Cys-L2”结构是配体结合部位,而酪氨酸激酶结构域对于细胞内的信号传导具有重要作用。同源性比对发现胰岛素样肽受体及其同源物的氨基酸序列在不同物种之间高度保守,且Sj ILPR与同为软体动物门头足纲的双斑蛸的相似性最高,为66.27%。进化树分析表明,Sj ILPR与其他已确认的软体动物ILPRs聚在一起。通过免疫荧光技术对曼氏无针乌贼胰岛素样肽及其受体进行亚细胞定位分析,结果发现,成功转染了SjILP-EGFP的HEK293T细胞在细胞质及细胞膜上均有绿色荧光,说明Sj ILP定位在细胞质及细胞膜上,该结果与胰岛素样肽作为分泌蛋白在细胞中合成加工成为成熟的蛋白质,之后被转运到细胞外发挥作用的特征相吻合;而成功转染了Sj ILPR-EGFP的HEK293T细胞仅在细胞膜上发现绿色荧光信号,说明Sj ILPR定位在细胞膜上,该结果与其序列中存在跨膜结构域相符。通过实时荧光定量PCR研究曼氏无针乌贼胰岛素样肽及其受体基因组织分布特征和在生殖周期中变动规律。结果显示,Sj ILP和SjILPR在雌性曼氏无针乌贼的多种组织中都有表达,但它们在胰腺、卵巢和肝脏组织中的表达量均显著高于其它组织(P<0.05)。同时SjILP和SjILPR在雌性曼氏无针乌贼卵巢发育的4个时期中具有相同的表达规律:随着卵子发生和卵巢发育,Sj ILP和SjILPR在胰腺、卵巢和肝脏中的表达量从卵原细胞阶段至间质生长阶段逐渐升高,并在生殖发育高峰期的间质生长阶段最高,到性成熟的营养质生长阶段则显著降低(P<0.05)。这些结果表明胰岛素样肽及其受体可能在曼氏无针乌贼性腺发育和生殖功能调控中起作用。为进一步分析胰岛素样肽及其受体在曼氏无针乌贼生殖发育中的作用,通过RNA干扰的方法使Sj ILP和SjILPR基因沉默,并通过转录组测序分析干扰组与对照组之间的差异表达基因,发现与对照组相比,Sj ILP干扰组有6307个差异表达基因,包括下调基因2577个、上调基因3730个;而Sj ILPR干扰组有4314个差异表达基因,包括下调基因2586个、上调基因1728个。这些基因富集到与性腺发育相关的信号通路,包括细胞周期(Cell cycle)、卵母细胞减数分裂(Oocyte meiosis)、黄体酮介导的卵母细胞成熟(Progesterone-mediated oocyte maturation)、性腺发育(Gonadal development)、促性腺激素释放激素信号通路等。我们从中挑选出4个与性腺发育直接相关的下调基因,包括卵黄蛋白原1(vitellogenin1,Vg1)、卵黄蛋白原2(vitellogenin2,Vg2)组织蛋白酶L1-like(cathepsin L1-like,CtsL1-like)和卵泡抑素(FST),通过实时荧光定量PCR方法进一步验证Sj ILP和Sj ILPR基因的RNA干扰对这些基因表达的影响。结果显示,RNA干扰能有效抑制卵巢和肝脏中SjILP和Sj ILPR基因的表达(P<0.05),同时也能使其相关基因Vg1、Vg2、CtsL1-like和FST在卵巢和肝脏中的表达水平显著下调(P<0.05)。这表明Sj ILP及Sj ILPR基因可能通过影响下游卵巢发育相关基因的表达进而调控乌贼的生殖发育过程。