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目的:
1、设计小鼠NF-κB的反义寡核苷酸,探讨其对小鼠巨噬细胞分泌TNF-α、IL-6等炎症因子的影响。
2、研究LPS及Ti颗粒对炎症因子分泌的影响。
方法:设计并合成小鼠NF-κB的反义寡核苷酸链(含19个碱基)及对应的正义寡核苷酸链。体外培养小鼠巨噬细胞RAW264.7,实验分为六组,每组六孔。分别为巨噬细胞组(Con组)、巨噬细胞+脂质体组(lipofecter组)、巨噬细胞+脂质体+正义寡核苷酸组(Sense组)、巨噬细胞+脂质体+反义寡核苷酸组(Antisense组)、巨噬细胞+内毒素(LPS组)、巨噬细胞+钛颗粒组(Ti 组)。Antisense组、Sense组利用脂质体分别将NF-κB的反义寡核苷酸链和正义寡核苷酸链导入巨噬细胞;lipofecter组、LPS组与Ti 组分别使用脂质体、内毒素、钛颗粒作为不同的干预因素,进行实验;Con组不加刺激因素,然后的操作与实验组相同。在5%CO2培养箱中培养,分别取培养3h、24h、48h时各组上清液50μl,ELISA法分别测定上清液的NF-κB和TNF-α、IL-6的含量。48h时收集细胞,Trizol法提取总RNA。M-MLV一步法行RT-PCR,逆转录TNF-α和IL-6 mRNA。产物在1%琼脂糖凝胶上电泳,采用凝胶成像分析系统成像,测量吸光度值,计算mRNA表达水平相对值。
结果:
1、在培养3h时,各实验组NF-κB、TNF-α、IL-6数值与Con组比较差异无统计学意义。
2、在培养24h时,Antisense组NF-κB、TNF-α、IL-6数值与Con组数值明显减少,差异有统计学意义,LPS组、Ti组较Con组明显增加,差异有统计学意义。lipofecter组、Sense组数值与Con组比较差异无统计学意义。
3、在培养48h时,各实验组数值与对照组比较和24h时的数值有相同的变化趋势。RT-PCR法测mRNA (TNF-α、IL-6)表达水平相对值:Antisense组目的条带较Con组灰度值明显减弱,LPS组、Ti组目的条带较Con组灰度值明显增加,lipofecter组、Sense组目的条带灰度值与Con组相似。
结论:
1、设计并合成的NF-κB的反义寡核苷酸成功地转染进了巨噬细胞。
2、NF-κB的反义寡核苷酸成功抑制了NF-κB的表达,进而抑制了TNF-α、IL-6等炎症因子的表达。LPS、Ti都能明显刺激巨噬细胞分泌炎症因子。NF-κB的正义寡核苷酸无上述作用。
3、NF-κB参与了小鼠巨噬细胞表达TNF-α、IL-6等炎症因子。