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猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是严重危害全球养猪业的重要病原。PRRSV主要感染以猪肺泡巨噬细胞（PAMs）为代表的单核-巨噬细胞系,从而影响猪肺泡巨噬细胞的生物学功能。因此,分析PRRSV感染PAMs的转录组学变化,可以为深入研究PRRSV影响PAMs功能的分子机制奠定必要的基础。本研究拟通过高通量测序技术分析PRRSV感染和干扰素（IFN）刺激的PAMs转录组的动态变化,并进一步对PRRSV感染和IFN刺激PAMs的转录组学进行比较分析;同时,拟分析PRRSV Nsp1 β核聚集现象的调控机制及其对Nsp1 β生物学功能和PRRSV复制的影响,以期为深入研究PRRSV影响PAMs免疫功能及其免疫逃逸的分子机理提供科学依据。用PRRSV JXwn06毒株体外感染PAMs,采用高通量测序技术分析不同感染时相PAMs的转录组学变化。结果表明,基于猪的参考基因组,共鉴定出PRRSV感染PAMs的38222个mRNA,12987个注释长非编码RNA（lncRNA）,并预测出17624个新lncRNA。与未感染组PAMs比较,感染6 h组显著变化的mRNA、注释lncRNA和新lncRNA的数量分别为1220、241和439个;感染9 h组显著变化的mRNA、注释lncRNA和新lncRNA的数量分别为3903、974和2608个;感染12 h组显著变化的mRNA、注释lncRNA和新lncRNA的数量分别为10330、3534和7562个;PRRSV感染各组均显著变化且变化趋势一致的mRNA、注释lncRNA和新lncRNA的数量分别为868、132和241个。利用荧光定量PCR证实了 PRRSV感染过程中mRNA（GBP1、HPDL、PRCP 和 CD163）、注释 lncRNA（XR301539.1 和 XR297549.1）和新 lncRNA（TCONS-00048171和TCONS-00154605）的显著变化。利用生物信息学技术,对各组差异显著的mRNA进行了 GO功能注释和KEGG生物通路富集分析。结果显示,许多促炎因子和趋化因子、与干扰素相关的信号通路及吞噬和抗原加工递呈通路中的基因均显著下调,表明PRRSV感染PAMs的多种免疫生物学功能均受到抑制。同时,对部分注释lncRNA的功能进行了预测。结果表明,PRRSV感染后显著变化的lncRNA XR297549.1可能对炎症相关基因PTGS2存在顺式和反式调控作用。利用高通量测序技术分析了 IFN-α刺激不同时相PAMs的基因转录组变化。结果表明,与未刺激组比较,IFN刺激6 h组显著变化的mRNA、注释lncRNA和新lncRNA的数量分别为3951、423和1318个;IFN刺激12 h组显著变化的mRNA、注释lncRNA和新lncRNA的数量分别为9305、902和1975个;IFN刺激各组均显著变化且变化趋势一致的mRNA、注释lncRNA和新lncRNA的数量分别为1801、311和693个。利用荧光定量PCR证实了IFN刺激后mRNA（HPDL、DPYSL2、PRCP 和 NAAA）,注释 lncRNA（XR301539 和 XR297549.1）和新 lncRNA（TCONS00048171和TCONS00154605）的显著变化。利用生物信息学技术,对各组差异显著的mRNA进行了 GO功能注释。结果表明,差异基因所属的生物学过程主要涉及免疫应答和细胞周期等。KEGG生物通路富集分析结果表明,差异基因主要富集在环境信息进程相关通路中的细胞因子受体相互作用、人类疾病相关通路中的流感病毒感染以及有机系统相关通路中的趋化因子信号通路等。对IFN刺激后显著上调且高表达的注释lncRNA进行了功能预测,结果表明IFN刺激lncRNA XR307435.1和XR304488.1可能顺式调控编码抗病毒蛋白的OAS1和PML基因,XR308080.1可能顺式调控编码模式识别受体IFIH1基因,而XR297412.1可能反式调控编码抗病毒蛋白ISG15基因的表达。对PRRSV感染和IFN刺激PAMs显著变化的mRNA和lncRNA进行了比较分析。结果显示,均上调的mRNA、注释lncRNA和新lncRNA的数量分别为80、16和34个;均下调的mRNA、注释lncRNA和新lncRNA的数量分别为169、17和42个;PRRSV感染上调而IFN刺激下调的mRNA、注释lncRNA和新lncRNA的数量分别为1、0和0个,PRRSV感染下调而IFN刺激上调的mRNA、注释lncRNA和新lncRNA的数量分别为10、0和1个。其中,编码参与PRRSV入侵的重要受体CD169的SIGLEC-I基因,编码细胞表面蛋白CD106的VCAM1和编码C1酯酶抑制因子的SERPING1在IFN刺激中显著上调,而在PRRSV感染中显著下调。对PAMs呈现不同抗病毒状态的PRRSV感染9 h组和IFN刺激6 h组进行转录组学差异比较。结果显示,差异显著的mRNA、注释lncRNA和新lncRNA的数量分别为5549、626和1503个,表明PAM呈现异常和正常抗PRRSV的细胞反应时基因转录水平差异明显。对差异mRNA的GO基因功能富集分析结果表明其所属的生物学过程主要包括免疫应答进程、免疫应答进程的调节和防御反应等;所属的细胞组分主要包括细胞质、线粒体和细胞器膜等;所属的分子功能主要包括小结合蛋白连接酶结合,泛素蛋白连接酶结合和电子载体活性等。对差异mRNA的KEGG生物通路富集分析结果表明差异基因主要富集在疱疹病毒感染、A型流感感染、肺结核等人类疾病相关通路中;溶酶体和吞噬体等细胞进程相关通路中及抗原加工递呈和破骨细胞分化等生物体系统相关通路中。此外,分析组间差异显著的mRNA发现,IFN刺激组中显著上调且高表达的前40个mRNA中有多个编码已知的抗病毒蛋白,包括 OASL、ISG15、GBP1、SAMHD1、IFITM1、IFITM3、IFIT1、IFIT3和BST2等,表明抗病毒基因转录水平的差异是PAMs呈现正常和异常抗PRRSV状态的重要标志之一。Nsp1β是PRRSV复制和抑制宿主先天性免疫的重要蛋白。已有研究表明,在PRRSV感染过程中,Nsp1β逐渐聚集在细胞核中,但其分子机制尚不清楚。采用点突变技术将PRRSV JXwn06毒株Nsp1β上各赖氨酸位点突变为精氨酸,利用Western Blot技术和激光共聚焦技术鉴定了各突变体对Nsp1β表型的影响。结果显示,第124位赖氨酸突变后会产生剪切带;第200位突变后会呈现两种表型:一是出现明显的蛋白翻译后修饰条带,二是呈核质点状分布,且主要分布在细胞质中。进一步分析了 K124R突变引起蛋白剪切的分子机制。利用点突变技术对第124位氨基酸和其所在保守基序123-GKYLQRRLQ-131进行定点突变,结合Western Blot分析,发现当第124位为精氨酸时会导致剪切带的产生。当第124位赖氨酸突变为色氨酸（W）或天冬氨酸（D）时,突变体与K200R突变体呈现类似的蛋白翻译后修饰条带,但激光共聚焦结果表明仅K200R突变体呈现明显的核质点状分布。此外,双荧光素报告系统检测表明仅K200R突变显著降低Nsp1β对IFN-β转录活性的抑制作用。分析了 K200R突变影响Nsp1β核质分布的机制。利用点突变技术将第200位赖氨酸分别突变为各类氨基酸,Western Blot和激光共聚焦技术分析表明第200位赖氨酸对维持Nsp1β的正常表型十分重要。对Nsp1βC端延伸域的氨基酸进行突变,利用激光共聚焦技术和双荧光素报告系统分析了影响Nsp1β核质分布及拮抗IFN-β转录活性的关键氨基酸。结果显示,F194、F196、K200、W201、Y202和G203位氨基酸突变均不同程度影响Nsp1β在细胞中的分布,且突变体抑制IFN-β转录活性的能力均显著降低。氨基酸序列比对发现PRRSV Nsp1β C端延伸域末端存在保守的FxFxxxKWYG基序。利用激光共聚焦和双荧光素报告技术分析了 FxFxxxKWYG基序对Nsp1β的核质分布和抑制IFN-β转录的影响,结果显示缺失该基序的Nsp1β几乎全部分布在细胞质中,呈点状分布,且抑制IFN-β转录活性的能力显著降低。利用感染性克隆技术鉴定了 Nsp1β关键氨基酸突变对病毒增殖的影响。结果显示,在MARC-145细胞上,RvJXNsp1βK124R各时相的病毒滴度与亲本病毒RvJXwn均无显著差异;RvJXNsp1βK200R在24h和36h时的病毒滴度明显低于RvJXwn;而RvJXNsp1βF194A各时相的病毒滴度均显著低于RvJxwn,由此表明FxFxxxKWYG基序影响Nsp1β的核聚集和病毒增殖。利用激光共聚焦技术分析RvJXNsp1βK200R和RvJXNsp1βF194A感染MARC-145细胞后Nsp1β的核质分布情况,结果表明虽然Nsp1βK200R和F194A突变体均能入核,但F194A突变体入核进程明显减慢,且主要分布在细胞质中。综上所述,本研究经比较转录组学分析筛选并鉴定出PRRSV感染和IFN刺激PAMs的差异表达基因,从转录水平上揭示了 PRRSV感染潜在的免疫逃逸机制;揭示了参与逃逸先天性免疫的病毒蛋白Nsp1β核聚集的分子机制。研究结果为深入研究PRRSV影响肺泡巨噬细胞免疫功能及其免疫逃逸的分子机理提供了科学依据,也为PRRSV新型疫苗的设计提供了新的思路。