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目的:肺癌可分为非小细胞性肺癌(NSCLC)和小细胞性肺癌(SCLC)。NSCLC是肺癌中最常见的一种。约占肺癌病例的70%-80%,依细胞类型不同,肺癌患者的5年生存率亦只有6%～16%。但有数据显示如果可以早期发现、诊断和治疗,这些患者的五年存活率可达60%-90%,因此不管是否存在外科治疗机会,提高肺癌患者生存期最好的办法就是早期发现,早期诊断,早期治疗[1]。研究证明,p16基因启动子区域的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸岛(cytosine guaninedinucleotide island,CpG岛)异常甲基化在肿瘤发生组织增生和化生阶段已经出现,是P16基因失活的一个重要机制,并极有可能是肺癌发生的早期事件,故对肺癌的早期诊断具有很大价值[2]。所谓DNA甲基化是指生物体内在DNA甲基转移酶(DNMT)的催化下,以S-腺苷蛋氨酸(SAM)为甲基供体将甲基转移到CpG二核苷酸的胞嘧啶的5’末端,形成mCpG的过程。甲基化与基因转录呈负相关,其机制可能是[3]:直接干扰特异的转录子和各自启动子识别位点的结合;通过改变染色质结构,介导转录抑制;甲基化DNA位点直接与转录抑制子结合,诱导基因沉默。p16基因又称为多肿瘤抑制基因( multiple tumor suppressor 1 ,MTS1) [4] ,是肺癌中最易发生甲基化的抑癌基因,该基因位于人类染色体9p21上,全长8.5kb ,由两个内含子和三个外显子组成。抑癌基因p16编码蛋白P16 ,是细胞周期蛋白CDK4和CDK6抑制剂,它阻止pRB磷酸化失活,使细胞周期阻滞于G1期。P16基因启动子区域富含CpG岛,当受到各种有害因素影响时,容易发生甲基化,从而抑制P16基因转录,导致基因沉默,细胞异常增生,导致肿瘤的发生[5]。Belinsky等证实p16基因的异常甲基化发生在肺癌的早期,随着肿瘤进展而增高。本研究利用甲基化P16基因作为肿瘤标志,应用实时荧光定量PCR技术,检测了30例不同状态的NSCLC患者,进而对此法的临床意义进行了研究[6]。方法: 1.应用体外重组的方法构建甲基化R和非甲基化H的DNA标准品。分别培养P16基因启动子甲基化阳性细胞株Raji(B细胞淋巴瘤来源)和甲基化阴性细胞株Hela(宫颈癌来源),使细胞数量不少于107,然后提取基因组总DNA ,经亚硫酸氢钠处理后,CpG中未甲基化的胞嘧啶C转变为尿嘧啶U,扩增时转变成T ,而甲基化的胞嘧啶mC保持不变,在PCR反应时,分别以不同的特异性引物扩增,来检测该CpG位点的甲基化状态[7]。根据已知基因序列分别设计构建标准品用PCR特异性引物M(甲基化体系)和U (非甲基化体系),用普通PCR方法调取P16基因启动子和第一外显子区发生甲基化的目的基因片段,片段长度262bp,(其中包括了我们拟用real time PCR定量的目的片段)并将其连接到质粒载体PMD-18T上,转染至大肠杆菌感受态细胞JM-109中,经37℃过夜培养后筛选出重组体,提取、纯化质粒,根据吸光度计算出浓度,并换算成拷贝数。将构建的质粒DNA标准品,梯度稀释(107、106、105、104、103、102、101copies/μl)作为模板进行实时荧光定量PCR反应,分别制作P16基因甲基化和非甲基化标准曲线,并对标准品反应性能进行检测。2.分别设计Real Time PCR用特异性引物m(甲基化体系)和u(非甲基化体系),并利用构建成功的两个DNA标准品制作的标准曲线计算甲基化和非甲基化定量结果,得到甲基化百分比值,从而监测其甲基化发生水平。结果:1.构建的两个DNA标准品可以得到良好的扩增曲线、标准曲线和融解曲线,标准曲线相关系数大于0.98,可以在宽广的范围内进行准确定量;扩增效率0.8﹤e﹤1.2;目的产物融解曲线峰形单一[Tm值在88.2±1(P16基因甲基化),83.2±1(P16基因非甲基化)],且标准曲线显示线形关系良好,电泳结果和OD值结果显示,构建的质粒标准品纯度较好。A260/A280约2.0左右,表明标准品构建成功。2.应用荧光定量PCR技术分析非小细胞性肺癌(NSCLC)患者的甲基化水平,结果显示有显著性差异(P<0.05)。结论:荧光定量PCR技术检测非小细胞性肺癌(NSCLC)患者的甲基化水平具有临床适用性,为NSCLC的早期诊断提供了依据,进而可以更好的指导临床治疗,提高患者的存活率[8]。