论文部分内容阅读
夏季雌性哺乳动物的繁殖性能普遍降低,这与热应激改变卵巢卵泡发育和颗粒细胞功能有关。热应激可分为急性和慢性两种类型。尽管有研究报道热应激损伤卵巢功能,但慢性热应激影响卵泡闭锁和颗粒细胞凋亡的研究未见报道。本研究以小鼠为模型,分别开展以下三部分实验：第一部分：探讨急性热应激对中小卵泡发育的影响。实验选择20只7周龄的雌性CD-1小鼠,随机分成2组。实验开始前对小鼠进行同期超排处理,实验期间,实验组小鼠每天置于37℃,相对湿度50%～50%的生化培养箱中热应激处理10h,其余时间和对照组一样,置于25℃的鼠房中饲养,热应激处理持续6天。期间,每天检测小鼠的肛温和体重,第6天热应激结束后对小鼠进行超排处理,收集卵母细胞和卵巢,观察超排卵数及卵泡闭锁情况。研究结果表明：急性热应激可提高小鼠肛温和超排卵母细胞数量,并降低体重。第二部分：探讨慢性热应激诱发卵泡闭锁的机理。将48只体况相似的3周龄CD～1雌鼠随机分成两组,实验组小鼠每天置于42℃,相对湿度50%～60%的生化培养箱中热应激处理3h,其余时间和对照组小鼠饲养条件一致,记录每天的采食量,实验期为4周。分别在第7、14、21和28天热应激结束后称重,之后两组各随机选取6只小鼠,处死后收集血浆,测定雌二醇水平。同时摘取卵巢,一侧卵巢用于分析卵泡闭锁和颗粒细胞凋亡情况,另一侧用于检测热应激相关蛋白表达水平。研究结果表明：慢性热应激降低小鼠采食量、体重和血清雌二醇水平,增加卵巢组织热休克蛋白HSP70的表达,持续21天的慢性热应激增加有腔卵泡的闭锁率及颗粒细胞凋亡水平。第三部分：探讨热应激影响卵泡颗粒细胞凋亡的机理。(1)分离小鼠有腔卵泡,37℃或42℃培养24h,之后收集卵泡检测HSP70和芳香化酶蛋白的表达水平。(2)分离小鼠卵巢颗粒细胞,37℃或42℃无血清培养12h或24h,之后检测细胞培养液中雌二醇水平和颗粒细胞HSP70、芳香化酶和Bim蛋白的表达水平。(3)分离小鼠卵巢,37℃或41℃处理2 h,分离颗粒细胞,一部分用于检测HSP70、Bim、断裂caspase-3和caspase-3蛋白的表达,另一部分进行有血清(24h)和无血清(6h)的培养,观察颗粒细胞表型变化,收集细胞分析相关蛋白表达水平。此外,有血清组还进行台盼蓝、Hochest和TUNEL分析。(4)分离小鼠卵巢,37℃或41℃处理2h,分离原始卵泡和生长卵泡继续培养6h,然后收集卵泡分析HSP70的表达。研究结果表明：有腔卵泡热应激诱导HSP70表达并抑制芳香化酶表达；颗粒细胞热应激诱导HSP70表达,显著提高芳香化酶水平,降低培养液中雌二醇含量；卵巢热应激诱导分离培养颗粒细胞HSP70表达,增加有血清组颗粒细胞的凋亡及HSP70、Bim和断裂Caspase-3蛋白的表达；卵巢热应激后,原始卵泡HSP70表达水平显著高于生长卵泡。综上结果,可得如下结论：(1)37℃热应激6天可增加小鼠超排卵母细胞数量,促进中小卵泡发育；(2)42℃热应激21天可抑制小鼠颗粒细胞芳香化酶表达,降低血清雌二醇水平,提高有腔卵泡闭锁率和颗粒细胞凋亡水平。(3)Bim和caspase-3参与了热应激诱导的小鼠颗粒细胞凋亡。