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第一部分，目的:
苯丙酮尿症(Phenylkctonuria,PKU)是一种严重的氨基酸代谢障碍性疾病,呈常染色体隐性遗传。PKU主要是由于体内苯丙氨酸羟化酶(Phenylalaninehydroxylase,PAH)活性丧失,导致苯丙氨酸不能正常转化为酪氨酸而蓄积在体内,引起中枢神经系统的损伤,同时造成酪氨酸、多巴、肾上腺素、黑色素等生理活性物质的合成障碍,带来一系列的病理改变。该病发病率平均为1/11000,主要表现有智力发育迟缓、色素减少、尿液中含有大量的苯丙酮酸。目前已经证实PAH基因的点突变、缺失/重复突变会导致PAH活性降低或失活。PAH基因定位于12q22-q24.1,由125kb组成,含有13个外显子,转录1356bp的mRNA,翻译成含452个氨基酸残基的酶单体,4个酶单体聚合成有功能的苯丙氨酸羟化酶,参与苯丙氨酸的代谢。PAH基因可有多种突变类型,以错义突变为主,这些突变可发生在外显子、内含子、5-UTR和3-UTR区域。
我室采集了26例典型PKU患者血样,联合运用HRM、MLRA、DNA测序等方法进行PAH基因突变筛查,相对提高了PAH基因突变筛查的检出率,研究结果对PKU患者的基因诊断和产前诊断以及探讨可能的基因治疗有十分重要的意义。
材料与方法:
一、实验材料
26例典型苯丙酮尿症患者,由沈阳市妇女儿童保健中心提供,在家属知情同意情况下,抽取患者外周静脉血1～2ml。正常对照DNA样品来自实验室收集的健康无血缘关系体检个体。
二、方法
1、提取基因组DNA
使用试剂盒UniversalGenomicDNAExtractionKitVer.3.0提取患者及正常对照外周静脉血基因组DNA。
2、应用HRM结合DNA测序技术筛查PAH基因点突变
参考SaskiaBrautigam文献中的引物,加入荧光染料LCGreen分别扩增PAH基因全部外显子。对PCR产物采用HRM的单通道高分辨率熔解曲线突变检测系统(Idaho,USA)检测,应用HRM应用分析软件(LightScannerAnalysisSoftware)进行数据分析。对阳性结果采用DNA测序验证,确认突变的确切位点。
3、应用MLPA技术筛查PAH基因缺失/重复突变
使用针对PAH基因13个外显子特定序列设计的SALSAMLPAKITP055-B1PAH试剂盒(MRC,Holland),对模板基因组DNA进行杂交、连接、PCR反应,借助BeckmanCEQ-8000遗传分析仪进行毛细管电泳分离PCR扩增产物,所得数据经BeckmanCEQ-8000遗传分析仪的FragmentAnalysis软件分析得到原始峰图,再使用CoffalyserVersion9.0软件对数据进行分析,计算出被检测样本的每个外显子的拷贝数的相对峰面积比(relativepeakratio,RPR),得出对应外显子的直方图。
4、应用PCR-RFLP方法进行验证分析
查阅人类突变数据库(HGMD),对检测出的未报道突变,验证是否为单核苷酸多态性(SingleNucleotidPolymorphism,SNP),设计错配引物,错配碱基与包.括突变碱基在内的邻近碱基构成对应限制性酶切位点,应用聚合酶链反应.限制性片段长度多态性(polymerasechainreaction-restrictionfragmentlengthpolymorphism,PCR-RFLP)的方法对患者及73名无关正常个体使用错配引物进行PCR扩增,限制性内切酶酶切后,产物经8%中性聚丙烯酰胺凝胶电泳和常规银染检测。
结果：
1、HRM分析及测序结果
HRM技术结合DNA测序结果显示,26例PKU患者检测到43个突变(共20种不同突变位点),检出率达82.69%(43/52),其中c.584_585insA和IVS10+1G＞T突变在国内外未见报道,此外,R243Q(25%)突变为中国PKU患者最常见的突变位点。
2、MLPA检测分析结果
对于9例经HRM检测未发现两个突变的患者,采用MLPA分析筛查片段的缺失与重复,结果显示1例患者PAH基因第4外显子拷贝数增加。
3、PCR-RFLP检测分析结果
PCR-RFLP方法检测了数据库未报道的两个突变位点,结果显示:c.584_585insA和IVS10+1G＞T突变位点在73名无关正常个体中未检测到多态性等位片段。
结论:
26例PKU患者PAH基因突变筛查中,联合应用HRM、MLPA和DNA测序技术检测到44个突变(共21种不同突变位点),包括第4外显子拷贝数的增加,总检出率达84.62%(44/52),其中c.584_585insA和IVS10+1G＞T突变在国内外未见报道。
运用HRM、MLPA和DNA测序技术相对提高了PAH基因突变筛查的检出率,检测结果丰富了人类基因突变数据库,并为PKU临床诊断与产前诊断提供实验室依据。
第二部分，目的：先天并(多)指(趾)(synpolydactyly,SPD)是一种罕见的以手足畸形为主要症状的常染色体显性遗传病,除并指(趾)症状外,还伴有多指(趾),不同家系间以及同一家系不同患者间存在明显的表现度及外显率差异,典型表现为3-4并指及4-5并趾,蹼中的第4指及第5趾呈现部分或完全多指(趾)。该病致病基因为HOXD13,定位于2q31.1,含有2个外显子,基因全长为1365bp,编码343个氨基酸,外显子1编码蛋白中含有一个15A1a的多聚丙氨酸链(PloyA),外显子2编码蛋白中包含一个60个氨基酸的同源盒结构域。
本室前期已经在一个中国汉族并多指(趾)畸形家系中以HOXD13为候选基因进行突变筛查,检测出HOXD13基因剪接位点杂合突变c.781+1G＞A,该突变位点在人类突变数据库及PubMed文献中未见报道,我们证实了该变异为新的突变。在此基础上,我们构建了HOXD13基因表达载体,分别在mRNA和蛋白水平对该突变位点所导致的基因表达改变进行了检测和分析。
材料与方法：
一、实验材料
本室收集1个中国汉族SPD家系,前期实验以HOXD13为候选基因进行突变筛查,检测出HOXD13基因剪接位点杂合突变c.781+1G＞A,目前人类突变数据库及PubMed文献中未见报道,PCR-RFLP分析结果显示该家系正常个体及60例家系外无关正常个体中此位点该变异不存在,证实c.781+1G＞A非SNP。
二、方法
1、野生型与突变型HOXD13基因表达载体的构建
针对突变c.781+1G＞A,以p3xFLAG-HOXD13WT(含有HOXD13基因CDS区域)载体为基础,设计带有限制性内切酶位点的引物,通过PCR、酶切回收、连接、转染、质粒提取等步骤构建野生型HOXD13基因表达载体p3xFLAG-CMV-7WT与带有突变位点c.781+1G＞A突变型HOXDl3基因表达载体p3xFLAG-CMV-7MU,并进行测序验证。
2、突变型HOXD13mRNA检测
将构建好的野生型与突变型表达载体分别转染BGC823细胞,培养48小时后提取总RNA,反转录获得cDNA,以cDNA为模板扩增HOXD13基因,对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳初步检测,回收并进行测序验证。
3、突变型HOXD13蛋白检测
同上转染后的BGC823细胞培养48小时后提取总蛋白,WesternBlot检测野生型与突变型HOXDl3蛋白分子量。
结果:
1、野生型与突变型HOXD13基因表达载体构建
野生型p3xFLAG-CMV-7WT载体与突变型p3xFLAG-CMV-7MU载体测序结果显示无突变,开放阅读框架(openreadingframe,ORF)阅读正确。
2、突变型HOXD13mRNA检测结果
琼脂糖凝胶电泳检测结果显示突变型HOXD13PCR产物片段明显小于野生型,测序结果明确突变型HOXD13PCR片段大小为609bp,野生型HOXD13PCR片段大小为823bp,提示该家系中c.781+1G＞A突变位点影响了原先的剪接功能,而激活了一个隐蔽性剪接位点。
3、突变型HOXD13蛋白检测结果
WesternBlot检测结果显示突变型HOXD13蛋白分子量明显小于野生型HOXD13,野生型HOXD13蛋白分子量为36kD,根据蛋白质分子量、氨基酸组成计算器软件(http://www.proteomies.com.cn/tools/mwcal/MyMW.asp)预算突变型HOXD13蛋白分子量为19kD。
结论：
我们在一个中国汉族并多指(趾)畸形家系中首次检测出HOXD13基因c.781+1G＞A突变位点,该突变激活一个隐蔽性剪接位点,使得剪接后mRNA大小比正常少214bp,蛋白分子量由正常的36kD变为19kD,形成截短蛋白,引起相应功能的丧失,构成该家系疾病发生的主要原因。