实验背景及目的:表阿霉素(EPI)作为临床上经典的蒽环类广谱抗肿瘤药物,由于其较大的心脏毒性而影响了其在临床一线中的广泛应用。近年来,用药物化学手段改造药物化学结构而达到降低其毒性作用的方法较为常见。其中,研究得比较热门,同时也比较成熟的有酶激活式靶向前药设计策略等。国内外有大量的研究数据表明,肿瘤相关成纤维细胞中有成纤维激活蛋白alpha(FAPα)表达,而肿瘤的发生发展又与肿瘤相关成纤维细胞有密切的关联。以FAPα为介导的酶激活式靶向抗肿瘤前药设计策略正是利用肿瘤细胞内外的FAPα作为切入点和突破口,将具有较大毒副作用的母药改构成几乎无毒副作用且只能被FAPα特异性酶解的前药。而前药到达体内正常组织,由于缺少必要的工具——FAPα酶,不能产生相应的细胞毒性作用,从而达到预期降低药物毒副作用的目的。前药直接到达或经体内循环到达肿瘤组织,被特异性酶解释放出母药进而通过母药发挥抗肿瘤的疗效。在本课题组前期研究中,已将此FAPα为切入点的酶激活式靶向抗肿瘤前药设计策略成功应用于阿霉素(DOX),并经系统成药性研究验证可行。近年来发现,在临床上EPI的毒性特别是心脏毒性仍未得到解决且EPI比DOX更具有广泛应用的潜力,而EPI与DOX互为同分异构体,仅一个手性碳原子的空间构象互为顺反异构。因此,将此酶激活式靶向抗肿瘤药物设计策略应用于EPI将会是一个很有意义的尝试。前期研究中,已将母药EPI改构成前药Z-GP-EPI,然而,能否实现靶向抗肿瘤的疗效,降低心脏毒性,尚需实验考察。故本研究通过考察前药Z-GP-EPI的靶向抗肿瘤疗效和心脏毒性,首次对Z-GP-EPI的成药性进行初次评价。实验方法:1 Z-GP-EPI的靶向抗肿瘤疗效1.1体外抗肿瘤活性选用非肿瘤细胞(HEK-293、NIH-3T3)、肿瘤细胞(4T1)和转染后稳定高表达FAPα的细胞(NIH-3T3/FAPα+、4T1/FAPα+),以母药为对照,用MTT法考察Z-GP-EPI在浓度为0.15–50μM的细胞毒性。基于本课题组前期实验基础,验证同时检测Z-GP-EPI和母药EPI的HPLC方法 专属性(流动相:乙腈(A)-水(含0.1%TFA)(B),梯度洗脱:0-1 min,A为30%;1-5 min,A为30%-70%;5-11 min,A为70%;流速:1 m L/min;UVD波长:495 nm)。基于本课题组前期实验基础,选用Z-GP-DOX对rh FAPα的酶解活性进行确证。进而考察Z-GP-EPI能否被rh FAPα特异性酶解。将前药Z-GP-EPI(15μg/m L)与rh FAPα(1μg/m L)37°C条件下共孵育,于0 h,2 h,4 h,8 h,12 h,24 h及36 h取上清液,HPLC法同时检测Z-GP-EPI与EPI。1.2体内抗肿瘤疗效用乳腺癌4T1细胞构建Bal b/c荷瘤模型小鼠,将模型小鼠随机分为Z-GP-EPI高、低剂量组(3 mg/Kg和1.5 mg/Kg)和等摩尔剂量的EPI高、低剂量组(2 mg/Kg和1 mg/Kg)及Control组(10 m L/Kg)共5组,每组6只,经尾静脉注射隔天给药,连续3周。隔天观察、测量瘤体大小,绘制肿瘤生长曲线,计算相对肿瘤增值率。第一次给药22 d后颈椎脱位法处死小鼠,剥取瘤块,称重,计算抑瘤率。2 Z-GP-EPI的心脏毒性将Bal b/c小鼠随机分为Z-GP-EPI高、低剂量组(15 mg/Kg和7.5 mg/Kg),EPI组(5 mg/Kg)及Control组(20 m L/Kg)共4组,每组8只,经腹腔注射隔天给药,连续2周。隔天观察小鼠生存状态,记录小鼠死亡数,计算生存率,测量体重,绘制体重变化曲线。第一次给药14 d后股动脉取血约1 m L,离心得血清做心肌酶检测。颈椎脱位法处死后取心脏组织作常规HE检查、Massion检查和3-硝基酪氨酸蛋白免疫组化检查。实验结果:1 Z-GP-EPI的靶向抗肿瘤疗效1.1体外抗肿瘤活性根据48 h细胞存活率数据,Z-GP-EPI对非肿瘤细胞(HEK-293、NIH-3T3)的IC50>50μM,而EPI对非肿瘤细胞(HEK-293、NIH-3T3)的IC50<1μM;Z-GP-EPI对稳定高表达FAPα的细胞(NIH-3T3/FAPα+、4T1/FAPα+)的IC50与母药EPI相近(约为0.2μM)。Z-GP-EPI特异性酶解结果显示,2 h内可检测出游离EPI,在8 h约40%Z-GP-EPI被酶解,在36 h约95%Z-GP-EPI前药被酶解。1.2体内抗肿瘤疗效Z-GP-EPI高、低剂量组肿瘤的大小分别与Control组比较,均具有统计学意义,相对肿瘤增值率均小于40%。且Z-GP-EPI低剂量组与等摩尔剂量的EPI组相比,具有相近的抑瘤率(约55%)。2 Z-GP-EPI的心脏毒性Z-GP-EPI高、低剂量组均未见小鼠死亡,体重无明显降低。而EPI组在自第一次给药后第10 d出现死亡,至给药结束,小鼠生存率为50%,且体重明显减少。心肌酶谱检测结果均显示,Z-GP-EPI高、低剂量组与Control组无显著性差异,而EPI组与Control组有显著性差异。心脏HE检查、Massion检查和3–硝基酪氨酸免疫组化检查结果均显示,Z-GP-EPI高、低剂量组未发现明显病变,而EPI组发现心肌形态改变、溶解等明显病变。结论:1.Z-GP-EPI对正常细胞几乎无毒性作用,能被FAPα特异性酶解释放出母药EPI进而通过EPI发挥细胞毒性作用,且在本研究使用的动物模型中具有与母药相近的抗肿瘤疗效。2.Z-GP-EPI相比于母药EPI,明显改善心脏毒性。综上可初步判断,通过FAPα介导的酶激活式靶向抗肿瘤前药设计策略修饰得到的前药Z-GP-EPI保留了母药的抗肿瘤疗效,同时明显改善了心脏毒性,已达到策略修饰的预期目的。因此,Z-GP-EPI也与Z-GP-DOX一样,有望成为新型FAPα酶激活式靶向抗肿瘤候选化合物,进入临床前研发。