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第一部分 c-Jun氨基末端激酶通路在大鼠缺血再灌注脑损伤中作用的研究
目的:
观察磷酸化的c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)在大鼠缺血再灌注损伤脑组织中的变化规律,探讨其抑制剂SP600125对大鼠缺血再灌注脑损伤的保护作用。
方法:
1.采用改良Longa线栓法制备大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型。实验动物随机分为对照组、缺血再灌注(IR)组、缺血再灌注+二甲亚砜(IR+DMSO)组、缺血再灌注+DMSO+SP600125干预(IR+SP)组。IR+DMSO组及IR+SP组随机分为缺血2 h再灌注6、12、24、72 h组。
2.采用TTC染色观察脑梗死体积,HE染色观察缺血坏死神经元改变。
3.采用免疫组化和蛋白免疫印迹法(western blot)检测各组活化的c-Jun氨基末端激酶p-JNK,观察p-JNK在缺血再灌注脑组织不同时程的变化规律。
4.观察p-JNK抑制剂SP600125对p-JNK表达的影响。
结果:
1.线栓法制备缺血再灌注模型成功率为75.6%;TTC染色可见大脑中动脉供血区梗死灶;HE染色可见梗死区神经元缺血坏死改变。
2.p-JNK免疫组化研究显示:对照组大鼠神经元、神经胶质细胞棕褐色染色阴性。IR+DMSO组再灌注6h神经元、神经胶质细胞胞核呈棕褐色染色;再灌注12h,胞核浓染,阳性细胞数增多:再灌注24h阳性细胞数减少;至72h阳性表达仍持续较高水平。SP600125干预组大鼠神经元、神经胶质细胞核为浅或中等程度棕黄色颗粒沉积,阳性细胞数较IR+DMSO组减少(P<0.05)。
3.Western blot研究发现,再灌注6h脑组织p-JNK表达升高,在12 h达高峰,24h表达略下降,72 h仍有较高表达。SP600125干预组较IR组及IR+DMSO组大鼠脑组织p-JNK表达显著降低(P<0.01),高峰不明显(P>0.05)。
结论
1.线栓法致大鼠脑组织缺血再灌注损伤后神经元、神经胶质细胞表现为坏死样形态改变。
2.p-JNK的活性在脑损伤时表现出时间依赖性增高,该变化可被SP600125抑制。
3.SP600125可减轻缺血再灌注造成的神经元损伤。
第二部分内质网通路在大鼠缺血再灌注脑损伤中的作用及p-JNK抑制剂的影响
目的:
观察内质网通路中的凋亡相关蛋白GADD153、caspase-12在大鼠缺血再灌注脑损伤不同时程的变化规律,并探讨p-JNK抑制剂SP600125对二者表达的影响。
方法:
1.建立大鼠大脑中动脉闭塞再灌注模型,实验动物随机分为对照组、缺血再灌注(IR)组、缺血再灌注十二甲亚砜(IR+DMSO)组、缺血再灌注+DMSO+SP600125干预(IR+SP)组。IR+DMSO组及IR+SP组随机分为缺血2 h再灌注6、12、24、72 h组。
2.采用免疫组化、Western blot及免疫荧光双标法检测缺血再灌注不同时间点GADD153、caspase-12的变化。
结果:
1.免疫组化和免疫荧光双标检测显示脑缺血再灌注后皮层和纹状体区GADD153表达均增高,神经元及神经胶质细胞胞核、胞浆呈棕褐色染色,阳性细胞主要位于纹状体区,皮层表达较少,P<0.05;Western blot结果显示再灌注6hGADD153表达增加,持续至72h仍明显增高,P<0.05。
2.应用SP600125干预后,与DMSO组比较,再灌注6、12h GADD153的表达变化不明显(P>0.05),24、72h GADD153的表达明显下降(P<0.05)。
3.免疫组化和免疫荧光双标检测显示脑缺血再灌注后皮层和纹状体区caspase-12表达均增高,神经元及神经胶质细胞胞浆呈棕褐色染色,而纹状体caspase-12表达明显高于皮层(P<0.05);Western blot结果显示再灌注6hcaspase-12表达增加,逐渐增高,至24达高峰(P<0.01),72h仍维持在较高水平。
4.应用SP600125干预后,caspase-12在缺血再灌注脑组织的表达明显低于无SP600125干预组(P<0.05),高峰期不明显(P>0.05)。
5.DMSO组免疫荧光双标染色显示,再灌注6h可见GADD153、caspase-12单标及双标阳性细胞,主要位于纹状体区;12~24h二者单标及双标阳性细胞数均明显增多(P<0.05),主要位于纹状体区,皮层区也可见少量表达;至72h,GADD153单标阳性细胞数减少,caspase-12单标阳性细胞数仍较多,双标阳性细胞数减少(P<0.05)。
6.与DMSO组比较,SP组GADD153单标阳性细胞数略有减少,caspase-12单标阳性细胞数及双标阳性细胞数明显减少(P<0.05)。
结论:
1.GADD153和caspase-12在缺血再灌注脑组织中的表达增加,内质网应激参与了缺血再灌注脑损伤的病理过程。
2.缺血再灌注脑损伤时,c-Jun氨基末端激酶通路可能通过激活caspase-12途径参与了内质网应激反应过程。