第一部分乏氧微环境对乳腺癌肿瘤再生细胞增殖的影响目的:肿瘤干细胞（CSCs）是一群具自我更新,多能分化及启动体内肿瘤生长潜能等干细胞特性的肿瘤细胞,也是肿瘤发生、发展、治疗抵抗和治疗后复发的关键驱动因素。乏氧是调节肿瘤干细胞自我更新的关键微环境因子,同时也可以使肿瘤干细胞富集,但是氧是否可以直接促进肿瘤干细胞的增殖并不清楚。本部分研究基于三维软纤维蛋白基质胶（3D fibrin）分离筛选出乳腺癌肿瘤干细胞（定义为肿瘤再生细胞,TRCs）,利用血管内皮生长因子抑制剂构建肿瘤乏氧模型,探讨体内外乏氧对肿瘤干细胞增殖的影响。方法:（1）使用苹果酸舒尼替尼构建肿瘤乏氧模型;观察两组肿瘤体积的大小,免疫荧光染色检测肿瘤组织内的乏氧区域及血管分布情况;（2）使用流式细胞仪从乳腺癌肿瘤组织中分选出ALDH高表达及低表达的肿瘤细胞,并将其接种至三维软纤维蛋白基质胶中,观察比较ALDH⁺和ALDH^-细胞形成的克隆数目。（3）Real time PCR检测两组肿瘤组织中干性基因的表达（ALDH1A1、OCT4、KLF4、SOX2）,Western blot检测ALDH1A1、PCK2的蛋白表达水平。（4）利用BrdU免疫荧光染色观察两组肿瘤组织中肿瘤干细胞的增殖情况。（5）将MCF-7、BT474及人原代乳腺癌TRCs分别置于常氧（21%O₂）和乏氧（1%O₂）的条件下培养6天,统计克隆体积及克隆数量;（6）利用CoCl₂模拟乏氧,观察不同浓度CoCl₂对MCF-7 TRCs克隆体积及数量的影响;（7）利用BrdU染色,观察两组细胞的增殖,同时利用PI和AnnexinV双染检测其凋亡;（8）采用Real time PCR检测干性基因在两组细胞中的表达差异。（9）将不同数量的常氧与乏氧MCF-7 TRCs接种于NOD-SCID小鼠乳腺垫下,观察两组的成瘤率及成瘤时间的差异。结果:（1）舒尼替尼处理组肿瘤体积明显缩小、乏氧区域明显增多,CD31染色显示血管分布减少。（2）ALDH⁺肿瘤细胞形成的克隆数目显著高于ALDH^-的肿瘤细胞;（3）舒尼替尼处理组干性基因表达水平明显升高,ALDH蛋白表达上调,PCK2蛋白表达下调。（4）舒尼替尼处理组乏氧区域内ALDH及BrdU表达升高。（5）在乏氧情况下,MCF-7、BT474及人原代乳腺TRCs克隆体积明显增大。（6）在一定的浓度范围内,随着CoCl₂浓度的增加,MCF-7 TRCs克隆体积逐渐增大。（7）与常氧对照相比,乏氧组MCF-7 TRCs显著增加DNA合成（S期）。（8）乏氧组肿瘤干性基因（CD133、OCT4、KLF4、ALDH、SOX2）的表达明显高于常氧组。（9）乏氧组的成瘤能力显著高于常氧组。结论:乏氧微环境可以明显促进乳腺癌肿瘤再生细胞的增殖,诱导其肿瘤干细胞表型的表达,同时明显增强乳腺癌肿瘤再生细胞在体内的致瘤性。第二部分乏氧微环境介导的TCA循环重塑与ROS生成的机制研究目的:通过分析TCA循环中间代谢产物的变化,探索乏氧介导ROS升高的机制;进一步探究ROS促进乳腺癌肿瘤再生细胞增殖的机制。方法:（1）在常氧和乏氧情况下,使用ROS荧光探针检测MCF-7以及人原代乳腺癌肿瘤再生细胞（TRCs）中的ROS水平,检测乏氧情况下经ROS清除剂NAC处理后MCF-7 TRCs细胞内ROS水平;（2）乏氧情况下,经不同浓度NAC和有氧情况下不同浓度H2O2处理后,观察MCF-7 TRCs的克隆体积;（3）乏氧情况下,使用ROS荧光探针检测MCF-7及MCF-7 TRCs细胞内ROS水平,同时在2D培养的MCF-7细胞中,加入不同浓度NAC,计数检测MCF-7细胞的增殖状况;（4）Western blot检测MCF-7及人原代乳腺癌TRCs中NF-κB和Akt的表达及NAC处理后NF-κB和Akt磷酸化水平的变化;（5）MCF-7 TRCs经NF-κB和Akt抑制剂处理后,Western blot检测NF-κB和Akt磷酸化水平,并观察MCF-7 TRCs的克隆体积的变化;（6）13C标记的葡萄糖处理MCF-7 TRCs后LC/MS/MS检测TCA循环的代谢变化;（7）Western blot检测TCA循环限速酶CS、IDH3G、OGDH的表达;（8）使用si RNA沉默MDH2、IDH3G后,观察MCF-7 TRCs克隆体积变化,同时,使用ROS荧光探针检测细胞内ROS水平;（9）使用si RNA沉默IDH3G,同时加入不同浓度的H2O2,观察MCF-7 TRCs克隆体积变化;（10）LC/MS/MS检测TCA循环中间产物柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、延胡索酸及苹果酸的含量;（11）使用不同浓度的α-酮戊二酸二甲酯（MOG）、琥珀酸二乙酯（SAD）、富马酸二甲酯（DMF）和L-苹果酸处理常氧MCF-7 TRCs后,ROS荧光探针检测细胞内ROS水平;（12）常氧乏氧情况下,使用LC/MS/MS检测MCF-7 TRCs细胞内GSF含量;（13）在常氧与乏氧情况下,使用NADPH及GSH试剂盒检测MCF-7 TRCs胞内NADPH/NADP+及GSH/GSSG的比值;（14）GSH-MEE处理乏氧的MCF-7 TRCs后,使用NADPH及ROS荧光探针检测细胞内NADPH/NADP+及ROS水平;（15）加入不同浓度GSH-MEE处理MCF-7 TRCs后,观察克隆体积变化;（16）使用si RNA沉默IDH3G后,检测GSF的含量变化及细胞内NADPH/DNAP+的比值。结果:（1）乏氧情况下,MCF-7、人原代乳腺癌TRCs中ROS含量升高,经NAC处理后ROS含量下降,且呈浓度梯度依赖;（2）乏氧情况下加入NAC清除ROS后,有效阻碍了TRCs的生长;反之,常氧条件下加入低浓度的H2O2可促进MCF-7 TRCs的生长;（3）常规2D培养的MCF-7细胞在乏氧条件下具有更高的ROS水平,NAC处理降低ROS水平后,乏氧所致的生长迟缓得到明显恢复。（4）乏氧导致MCF-7 TRCs中NF-κB和Akt磷酸化水平升高,加入NAC后磷酸化水平受抑制;（5）使用NF-κB和Akt抑制剂后,MCF-7 TRCs NF-κB和Akt磷酸化减弱,增殖明显被抑制;（6）13C葡萄糖同位素示踪试验显示乏氧时MCF-7 TRCs的TCA循环明显减慢;（7）乏氧时,MCF-7 TRCs中TCA循环的限速酶CS、IDH3G、OGDH的表达均下调;（8）沉默MDH2后MCF-7 TRCs细胞内ROS水平升高且克隆体积增大;而沉默IDH3G后细胞内ROS水平降低,克隆体积明显缩小;（9）H2O2可以逆转沉默IDH3G后克隆体积的缩小;（10）乏氧时,TCA循环的中间产物柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、延胡索酸及苹果酸均升高,且延胡索酸及苹果酸升高尤为明显;（11）不同浓度的α-酮戊二酸二甲酯（MOG）、琥珀酸二乙酯（SAD）、富马酸二甲酯（DMF）和L-苹果酸处理常氧MCF-7 TRCs后,仅DMF使细胞内ROS水平升高且与浓度呈正比;（12）与常氧相比,乏氧MCF-7 TRCs细胞内GSF比例升高且胞内NADPH/NADP+及GSH/GSSG的比例均降低。（13）GSH-MEE处理乏氧MCF-7 TRCs后,细胞内NADPH/DNAP+升高,ROS水平降低,阻碍了乏氧对于TRC生长的促进作用;（14）琥珀酰化谷胱甘肽的升高以及NADPH/NADP+的降低可通过IDH3G补救。结论:乏氧导致TCA循环流动减慢,致使中间代谢产物延胡索酸堆积,而延胡索酸积累则导致琥珀酰化谷胱甘肽的形成,在GSF的形成过程中消耗了GSH及NADPH最终导致MCF-7 TRCs内的ROS水平增加。同时,ROS水平升高激活信号分子NF-κB和Akt,促进人乳腺癌TRC的生长。第三部分HIF-1α介导的PCK2下调在乳腺癌TRCs TCA循环重塑中的作用目的:以乳腺癌MCF-7细胞为模型,探究磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（PCK2）的下调表达对肿瘤再生细胞（TRCs）TCA循环中间代谢物（草酰乙酸、延胡索酸）的影响以及导致乏氧乳腺癌TRC中的延胡索酸积累的原因。同时进一步探究乏氧情况下PCK2下调表达的分子机制.方法:（1）乏氧情况下,Western blot检测MCF-7 TRCs中PCK2的表达情况;（2）使用四环素诱导的PCK2过表达系统,检测PCK2高表达后乳腺癌TRCs中延胡索酸,琥珀酰化谷胱甘肽（GSF）和ROS水平以及NADPH/NADP+和GSH/GSSG的比值;（3）利用OAA检测试剂盒检测有氧、乏氧情况下及PCK2高表达后OAA含量的变化;（4）利用同位素标记的13C葡萄糖处理MCF-7 TRCs后,使用LC/MS/MS检测PCK2过表达后TCA循环的流动情况;（5）Western blot检测MCF-7 TRCs中HIF的表达,同时沉默或过表达HIF-1α后检测PCK2蛋白的表达水平;（6）利用同位素标记的13C检测HIF-1α沉默后TCA循环的流动情况;（7）UCSC基因组浏览器和JASPAR分析PCK2的启动子区域是否存在HIF-1α结合位点,并用染色质免疫共沉淀技术进一步验证;（8）利用PCK2启动子萤光素酶测定荧光素酶的表达,以确定HIF-1α与PCK2之间的调控关系;（9）使用富马酸二甲酯（DMF）处理缺氧的MCF-7 TRCs,Western blot检测HIF-1α及PCK2的表达;结果:（1）乏氧时,MCF-7 TRCs的PCK2表达下调;（2）过表达PCK2后,延胡索酸、GSF和ROS水平降低,NADPH/NADP+和GSH/GSSG的比值增加;（3）乏氧时,MCF-7 TRCs细胞内OAA含量升高,PCK2过表达后OAA含量下降;（4）乏氧时,PCK2过表达后,TRCs的TCA循环加速,m+2和m+4形式的柠檬酸,α-酮戊二酸,延胡索酸和苹果酸比例升高;（5）常氧和乏氧乳腺癌TRCs均表达HIF-2α,而HIF-1α仅在乏氧的TRCs中显著上调。si RNAs沉默HIF-1α时,PCK2表达上调,过表达HIF-1α后,PCK2表达下调;（6）HIF-1α沉默后促进TCA循环的流动;（7）UCSC基因组浏览器和JASPAR分析揭示在PCK2的启动子区域存在多个HIF-1α的结合位点,并且Chip-PCR测定表明HIF-1α可以直接结合到PCK2的启动子区;（8）PCK2启动子萤光素酶测定显示,HIF-1α敲低增加萤光素酶的活性,HIF-1α过表达降低萤光素酶活性;（9）富马酸二甲酯（DMF）处理乏氧乳腺癌TRCs后,HIF-1α的表达增强,且PCK2表达降低。结论:PCK2下调导致的OAA积累阻碍了TCA循环的碳流动并导致乏氧乳腺癌TRCs中的延胡索酸积累;缺氧诱导的HIF-1α负调节PCK2表达,延胡索酸积累进一步加强了这种反馈。