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壳寡糖具有多种独特的生理功能,其活性与聚合度和乙酰化程度有很大关系。壳聚糖酶能专一性降解壳聚糖制备壳寡糖,催化效率高,产物易于分离,反应条件温和,具有工业应用的价值。已报道的壳聚糖酶大多遵从内切型反应机制,其水解产物聚合度分布随机、乙酰化位点复杂,水解终产物多为壳二糖、壳三糖等短链寡糖产物。因此,了解壳聚糖酶产物聚合度差异的分子机制,研究特定聚合度区间壳寡糖酶法制备具有重要意义。本课题旨在利用X-射线晶体法解析GH46家族壳聚糖酶的复合物晶体结构,了解GH46家族壳聚糖酶的底物结合机制及催化机理,探索壳聚糖酶产物聚合度差异的分子机制。首先,利用X-射线晶体法成功解析了植物内生菌Gynuella sunshinyii来源的GH46壳聚糖酶GsCsn46A和解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens来源的GH46壳聚糖酶BaCsn46A与壳四糖、壳五糖的复合物结构。阐明了 GH46家族壳聚糖酶与壳寡糖底物(-5—+3位点)的详细结合机制,发现了 GH46家族壳聚糖酶催化凹槽非还原端的3个底物结合新位点。其次,复合物结构显示GsCsn46A的催化凹槽中糖链底物均结合于非还原端一侧,且酶的底物结合口袋处于“关闭”状态。这一现象验证了 GH46家族壳聚糖酶在催化过程中的变构反应机制:糖链底物优先从非还原端被壳聚糖酶催化凹槽识别并结合,同时酶催化凹槽发生变构,底物结合口袋“关闭”并发生反转型(Inverting)水解反应。此发现进一步完善了现有的GH46家族壳聚糖酶的底物识别机制和催化机理。最后,根据获得的两种壳聚糖酶的结构信息设计了16组定点突变,通过测定各突变体对壳聚糖的酶活性及水解产物分布,验证了 GH46家族壳聚糖酶催化凹槽关键氨基酸残基功能,并筛选出GsCsn46A的一种突变体N21W能在保留一定壳聚糖水解活性的同时,基本丧失对壳四糖的水解能力,使水解产物中聚合度≥4的壳寡糖比例明显提高,可用于制备更高聚合度壳寡糖产物。本研究解析了两种GH46家族壳聚糖酶的复合物结构,阐明了GH46家族壳聚糖酶的底物结合机制与催化机理,从分子水平上揭示了 GH46家族壳聚糖酶产物聚合度差异的潜在机制。在此基础上基于蛋白质结构信息,通过定点突变获得了一种水解产物中较高聚合度壳寡糖比例有所提升的壳聚糖酶突变体。上述研究为特定聚合度区间壳寡糖的高效酶法制备提供了理论依据,也为壳聚糖酶的进一步理性改造提供了研究基础。