人类基因组计划完成在即，一些新的技术和学科，如microarray和Bioinformatics的应用越来越广范和成熟。这些技术给肿瘤学的研究也带来了崭新的面貌。我们实验室建立了一个cDNA array技术平台，运用这个平台分析了肝癌的基因表达谱，寻找肝癌发生机制中的相关基因；并且对其中的一些基因做了深入的细胞功能学研究。在对array结果的分析中涉及到对大量数据的分析和公共数据库的利用，这些数学计算的方法也被运用到肿瘤研究中一些其他领域，我的论文就是围绕这两个方面开展的。论文的第一部分描述了cDNA array的制作和在肝癌研究中的应用。来自下丘脑－脑垂体－肾上腺、骨髓瘤、正常肝和肝癌组织cDNA文库的克隆，经过序列合并归类，筛选出了代表14088个独立基因或独立EST的克隆。这些克隆的PCR产物经过浓缩后点制到尼龙膜上。利用这个array，分析了肝癌及其癌旁正常组织的基因表达谱。尽管肝癌组织之间的基因表达存在很大的异质性，仍然发现有72个基因的表达在过半的肿瘤组织中一致下调，84个基因表达上调。一组叫肝富集的转录因子（LETFs）被发现参与到21个下调基因的表达调控中去。通过Northern杂交，证明其中的一个转录因子C/EBPα的表达在肿瘤中一致下调，而其他LETFs基因表达上调，提示它们可能会同肿瘤的发生有关系。这部分工作是同许亮博士合作完成的。<WP=3>对表达谱的进一步分析，引起我们对一个Rho蛋白家族成员——Cdc42的注意。用RT－PCR、Northern杂交和免疫组化的方法证明这个基因在65%左右的肝癌样品中表达上调。用免疫组化的方法还观察到EGFR的表达在很大一部分（70%）肝癌组织中呈阳性。已有研究表明EGF对肿瘤细胞运动的激活可能通过Rho GTP酶蛋白家族，但是对Cdc42在此过程中具体作用的研究，目前还很不充分。在肝癌细胞株BEL-7404中转入Cdc42的显性失活突变（N17Cdc42）或者用EGFR的抑制剂AG1478，都可以阻遏EGF诱导的线形伪足形成和细胞对Matrigel的浸润。另外，过量表达野生型Cdc42可以使肝癌细胞对低浓度的EGF更为敏感。这提示Cdc42可能是EGF诱导肝癌细胞浸润的必要条件。然而转入持续激活突变的Cdc42（V12Cdc42），细胞的浸润能力仍旧需要EGF的激活。进一步实验显示，EGF的刺激不能改变胞内Cdc42的表达和活化状态。这些结果提示在EGF诱导的浸润过程中，Cdc42可能不是EGF诱导肝癌细胞浸润的充分条件，而需它与别的通路交互作用可能是需要的。我论文的第二部分是关于利用EST序列库来预测肿瘤相关的mRNA剪接类型。从EST序列同基因组序列的比对，可以得出基因外显子的连接顺序，并得到各种预测的剪接类型。目前关于这种数据库已经有不少。因为EST数据库同时提供了详细的cDNA文库的组织来源资料，这就使得通过对EST计数来推测基因的组织分布成为可能。我们编了一个程序ASA（Alternative Splicing Assembler），并以此建立一个数据库BASD（Biosino Alternative Splicing Database）来预测肿瘤相关的剪接类型。目前分析了4322个基因，其中3490个（81%）基因被预测有可能发生选择性剪接。运用Fisher’s Exact检测，在26812个推测的剪接类型中，有2149个（8%）被认为是很可能与肿瘤相关。挑选了13个新的剪接类型和9个肿瘤相关的剪接类型，用RT-PCR来检验预测准确性；其中11个新的和8个肿瘤相关的剪接类型被确证。对这个数据库的挖掘一定会有助于肿瘤研究。此部分工作是同上海交大的张欣博士一起完成的。