背景胶质瘤(glioma)是神经系统最常见的原发恶性肿瘤,是危害人类健康最严重的疾病之一。目前临床上治疗胶质瘤的主要手段为手术治疗后辅以放疗和化疗,但经过该方案治疗后患者平均生存期也不超过1年。因而研究诱导胶质瘤细胞死亡的新策略迫在眉睫,最近研究证实诱导程序性坏死是一种有效杀死胶质瘤细胞的新途径。近些年,细胞死亡方式特别是程序性坏死一直是生命科学领域的研究热点。胶质瘤细胞对放化疗敏感性的降低认为与其耐受细胞凋亡有一定关系,最新研究表明诱导程序性坏死可有效杀死胶质瘤细胞。程序性坏死作为一种新型Caspase非依赖性程序性细胞死亡方式,是由受体相互作用丝-苏氨酸蛋白激酶1和3(RIP1 and RIP3)诱导的。程序性坏死被诱发时,RIP1通过其N末端和C末端之间的同型作用结构域(RIP homotypic interaction motif,RHIM)与具有激酶活性的RIP3结合形成坏死复合物necrosome来实现对程序性坏死的调控。在程序性坏死信号刺激下,RIP3通过RHIM与RIP1结合使RIP1发生磷酸化,磷酸化的RIP1和RIP3结合成RIP1-RIP3复合物进而促进程序性坏死的发生。在坏死复合体necrosome中RIP1和RIP3的磷酸化稳固了它们的联系并激活了其内旋激酶活性。随后坏死复合物necrosome激发了下游一系列事件比如细胞膜破裂、致死性的自噬、线粒体损伤等,这些都导致了细胞最终走向死亡。细胞的程序性坏死常伴有细胞膜破裂、细胞核DNA双链断裂、线粒体损伤、糖酵解障碍。糖酵解是肿瘤细胞在有氧条件下产生能量和中间代谢物的主要途径,但是非肿瘤细胞获得能量主要依靠柠檬酸循环。通过有氧糖酵解,肿瘤细胞将葡萄糖转变成ATP和丙酮酸。目前已知己糖激酶(HK)、磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶(PKM)调控了糖酵解过程中三个不可逆反应,它们是调控糖酵解流量的3个关键酶。在肿瘤细胞中,己糖激酶II(HK II)催化了第一个不可逆反应生成葡萄糖-6-磷酸(G-6-P),丙酮酸激酶2(PKM2)催化了最后一个反应产生丙酮酸和ATP。胶质瘤细胞中HK II和PKM2高表达并且它们的蛋白水平与胶质瘤的发生、恶性程度和生长密切相关。因而研究胶质瘤细胞糖酵解障碍机制有望成为未来胶质瘤治疗的潜在靶点。RIP1和RIP3已经被证实为程序性坏死的主要发起者,但其在程序性坏死肿瘤细胞糖酵解障碍中的作用仍然不清楚。紫草素是从紫草中提取出来的萘醌类天然化合物。近些年研究表明,紫草素是胶质瘤细胞程序性坏死有效的诱导剂,除此之外,紫草素可诱导其他类型的肿瘤细胞比如乳腺癌、骨肉瘤和多发性骨髓瘤发生程序性坏死。有报导指出紫草素可以抑制肿瘤细胞糖酵解,但其机制仍需进一步阐明。证实这个问题有助于我们进一步完善紫草素诱导胶质瘤细胞发生程序性坏死的机制,为解决临床上胶质瘤的治疗易发生耐药性这一问题提供新的思路和解决方案。目的利用人类和大鼠胶质瘤细胞系以及移植瘤鼠模型研究RIP1和RIP3在紫草素诱导的胶质瘤细胞糖酵解障碍中的作用和机制。方法1、通过乳酸脱氢酶(LDH)法检测细胞死亡率。2、Hoechst33342和PI染色后使用荧光显微镜观察紫草素作用于胶质瘤细胞后的形态学变化;通过Annexin V-FITC和PI(proptidium iodide)双染色使用流式细胞仪测紫草素诱导的胶质瘤细胞死亡方式。3、免疫共沉淀法揭示在紫草素作用下胶质瘤细胞中RIP1和RIP3的相互作用。4、建立BALB/C无胸腺裸鼠移植瘤模型,研究紫草素在体内环境对胶质瘤细胞G-6-P、丙酮酸(pyruvate)、三磷酸腺苷(Adenosine Triphosphate,ATP)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量的影响及相关蛋白表达变化的情况。5、使用DCFH-DA探针测胶质瘤细胞中活性氧(ROS)水平的变化,使用过氧化氢检测试剂盒检测胶质瘤细胞及裸鼠移植瘤组织内H2O2含量的变化。6、通过DTNB-GSSH检测法测胶质瘤细胞及裸鼠移植瘤组织中GSH含量的变化。7、通过半胱氨酸检测试剂盒检测胶质瘤细胞中及裸鼠移植瘤组织中半胱氨酸含量的变化。8、使用G-6-P检测试剂盒、ATP检测试剂盒、丙酮酸检测试剂盒检测胶质瘤细胞及裸鼠移植瘤组织中G-6-P、ATP、Pyruvate含量的变化。9、通过si RNA沉默RIP1及RIP3基因进而研究RIP1及RIP3在紫草素诱导胶质瘤细胞糖酵解障碍中的作用。10、Western-blotting分析胶质瘤细胞及裸鼠移植瘤组织中相关蛋白表达的变化。结果1、LDH法测细胞死亡率提示:紫草素可诱导胶质瘤细胞死亡,在一定范围内呈浓度依赖性。Hoechst33342和PI染色紫草素处理过的SHG44和U251细胞,观察其形态学变化发现PI染色阳性的细胞其并没有凋亡的典型特点比如核固缩或核分裂,说明紫草素诱导的胶质瘤细胞死亡方式不是凋亡。流式细胞学测试结果表明紫草素诱导胶质瘤细胞发生坏死而不是凋亡,Necrostatin-1(Nec-1)、GSK-872、丙酮酸钠可降低紫草素对胶质瘤细胞的杀伤作用。2、Western blotting结果表明在紫草素的作用下胶质瘤细胞中RIP1和RIP3表达水平提高并在一定范围内呈浓度依赖性,紫草素亦可以时间依赖性提高胶质瘤细胞中p-RIP1和p-RIP3的水平。免疫沉淀提示紫草素促进了胶质瘤细胞中RIP1和RIP3的相互作用而形成坏死复合体necrosome。3、G-6-P、pyruvate、ATP的测定值降低表明紫草素可诱导胶质瘤细胞糖酵解障碍,而RIP1抑制剂Nec-1、RIP3抑制剂GSK-872及沉默基因RIP1或RIP3均可缓解紫草素诱导的胶质瘤细胞糖酵解障碍。Western blotting结果表明紫草素可导致己糖激酶II(HK II)、丙酮酸激酶2(PKM2)及x-CT表达水平降低,这种效应可被Nec-1、GSK-872、si RNA沉默RIP1或RIP3基因抑制。4、DCFH-DA检测ROS水平表明紫草素诱导胶质瘤细胞中活性氧水平升高且呈浓度依赖性。H2O2和GSH测定结果表明紫草素可使胶质瘤细胞中H2O2积聚并引起GSH消耗,H2O2的聚集和GSH的消耗可被Nec-1或GSK-872抑制。紫草素引起胶质瘤细胞内源性H2O2积聚进而促使G-6-P和pyruvate含量降低、HK II和PKM2表达水平下降,而GSH预处理胶质瘤细胞后可使上述效应逆转。外源性H2O2也可下调胶质瘤细胞G-6-P、pyruvate、HK II和PKM2水平,GSH可减弱这种变化。5、紫草素诱导了胶质瘤细胞中半胱氨酸的消耗,并呈时间依赖性,这种现象可被Nec-1或GSK872阻止。Western blotting结果提示紫草素可下调x-CT水平并呈时间依赖性,Nec-1,GSK872,RIP1或RIP3基因沉默可抑制x-CT的降低。6、BALB/C无胸腺裸鼠移植瘤模型表明紫草素可明显抑制胶质瘤的生长,并使胶质瘤细胞中G-6-P、pyruvate、ATP、GSH、cysteine表达量降低。Western blotting结果表明紫草素下调了胶质瘤组织中HK II、PKM2、x-CT的表达并上调了RIP1和RIP3的磷酸化水平。结论1、紫草素可诱导胶质瘤细胞发生RIP1和RIP3依赖的程序性坏死。2、紫草素通过内源性H2O2的过度生成介导了胶质瘤细胞的糖酵解障碍。3、紫草素通过RIP1和RIP3诱导胶质瘤细胞内源性H2O2过度生成而导致糖酵解障碍。