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日本乙型脑炎(Japanese encephalitis,JE)是由日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)引起的一种严重影响中枢神经系统功能的虫媒性人兽共患传染病。Pr M蛋白是JEV的结构蛋白之一,主要存在于感染细胞内未成熟的病毒颗粒中。M蛋白由Pr M蛋白切割而来,参与病毒囊膜的构成,与E蛋白的C端相互作用,在细胞内对E蛋白进行折叠、修饰和装配,可诱生轻度中和抗体,与病毒核心组成具有感染性的病毒。同时JEV靶向神经元,可激活中枢神经系统中的星形胶质细胞和小胶质细胞信号,诱发大量细胞因子和促炎症因子的分泌,引起大脑炎症风暴。但是,Pr M在病毒复制、感染以及诱导中和抗体活性中的功能还不清楚,同时在细胞内如何对E蛋白进行折叠、修饰和装配也不清楚。另外JEV在引起大脑炎症风暴的过程中,还有哪些潜在的蛋白会产生作用,也没有得到完整的解答。本研究制备了Pr M/M的单克隆抗体,并通过间接ELISA、IFA、Western Blot等方法验证单抗的生物学特性。同时,利用i TRAQ技术对JEV P3感染U251细胞的蛋白质组进行了分析。具体研究内容如下:1、JEV Pr M/M单克隆抗体的制备构建JEV M蛋白的原核表达质粒p28a-sumo-M,并纯化蛋白免疫小鼠,通过细胞融合,结合间接ELISA和亚克隆技术筛选到1株特异性的单克隆抗体:6C11,同时获得4株能稳定分泌单抗的亚克隆株:E2、G3、D4、E4。经检测,四株亚克隆株的亚型均为Ig G2b,轻链均为Kappa链。经间接ELISA、IFA、Western Blot技术检测,这4株单抗均有较好的特异性,能识别天然的Pr M/M蛋白,同时收取的腹水效价能达到105。根据DNA Star软件预测M蛋白抗原位点可能存在的区域,将M蛋白分段表达,构建了p KG-M1和p KG-M2两段原核表达质粒,经Western Blot检测发现M蛋白的抗原位点可能存在前半段,即第1-126个碱基区。2、JEV P3感染U251细胞的蛋白质组学分析将JEV P3株感染U251细胞后,收集细胞样品,利用i TRAQ技术对样品进行蛋白质组学分析。鉴定出有意义蛋白共1780种,其中大部分蛋白参与细胞和细胞器的组成,部分蛋白参与新陈代谢、生物调节、免疫应答和刺激,还有少数蛋白参与酶活性的调节、分子转导和物质运输。对蛋白进行定量分析,发现与对照组相比,在感染病毒的U251细胞中共鉴定到54种上调表达蛋白和35种下调表达蛋白,利用相对荧光定量技术检测了8种上调表达蛋白和1种下调表达蛋白的m RNA,均与i TRAQ技术分析的相吻合。