寡糖是乳中含量第三的大分子物质,包括游离寡糖和糖蛋白等复合物寡糖。市售婴儿配方奶粉的研发已经将蛋白质、脂肪、维生素、微量元素等成分在种类、含量上调整到接近甚至高于母乳的水平,但是奶粉喂养的婴儿其健康状况仍明显不如母乳喂养的婴儿,这种现象使得配方奶粉的开发优化亟需新的方向——乳寡糖。目前对于乳中游离寡糖功能的研究已经有了大量的报道,但对于乳中糖蛋白寡糖的关注却较少。众所周知,在生物体内糖基化对蛋白质分子的生物学功能具有极其重要的作用,而乳中糖蛋白作为一种外源性蛋白质,糖基化对其功能的影响又如何呢?本实验室前期对人乳和牛乳N-链寡糖组的结构和功能进行了较为深入的研究,结果发现两者均具有抗菌及促益生的作用,但人乳要明显优于牛乳。该结果是针对从蛋白质上释放下来的自由N-链寡糖的结果,然而在乳中,N-链寡糖是连接在蛋白上以糖蛋白的形式被摄入婴儿体内的,当糖以糖蛋白形式进入婴儿体内其所具有的功能和作用机制如何尚未可知,因此,对乳蛋白质糖基化进行进一步研究具有重要意义。本文以人乳和牛乳蛋白质、去糖蛋白质及N-链寡糖组为研究对象,首先建立了乳蛋白去糖基化的方法,并对其进行优化。在此基础上,进一步探究N-链寡糖在乳蛋白上的结合(即N-糖基化)对乳蛋白生物学功能的影响,并对牛乳及人乳源样品的抗菌活性(抑制病原菌生长和抗致病菌粘附活性)功能进行比较。具体研究内容及结果如下:1、去糖基化方法的建立和优化为了实验的顺利进行,制备符合实验要求的样品非常重要,因此需要一个合适的方法。本文主要对其中的如下关键环节进行了试验和优化:脂质的去除、游离糖的去除、乳中蛋白质的去糖基化、NN-链寡糖与去糖蛋白的分离和N-链寡糖的进一步纯化。最终确立的最佳的组合为:用分子截留量为8000～14000 Da的透析袋对去脂乳进行低温透析以去除游离寡糖和其他小分子,获取乳蛋白质;采用PNGaseF酶水解释放N-链寡糖,连续反应三次,每次加入新的酶,总时间为16×3 h;用10 kDa超滤管进行低温离心以达到使去糖蛋白与N-链寡糖分离的目的;所得N-链寡糖组进一步采用G-25葡聚糖凝胶层析柱进行纯化。2、N-基化对乳蛋白质抑制病原菌生长活性的影响研究本研究以4种常见致病性病原菌(金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌和单增李斯特氏菌)作为目标菌种,以人乳及牛乳蛋白质、N-链寡糖组和去糖蛋白质为研究对象,考察了目标底物对致病菌的抑生长作用。实验结果表明:去糖基化前后,人乳与牛乳蛋白样品的抑生长作用并无明显变化,而且无统一的规律,其主要因致病菌的不同而不同。简言之,糖基化与否对人乳与牛乳蛋白抑制致病菌生长作用无显著影响。人乳和牛乳释放下来的N-链寡糖对4种常见致病菌均具有非常显著的抑制生长活性,所有乳蛋白样品活性均显著低于N-链寡糖,且人乳与牛乳无显著差异。经模拟胃液消化后,人乳与牛乳蛋白对致病菌的抑生长作用与未经模拟胃液消化的结果没有大的差别。3、N-糖基化对乳蛋白抗致病菌粘附活性影响的研究本研究以常见致病性病原菌鼠伤寒沙门氏菌作为目标菌种,以人结肠腺癌细胞(Caco2 cell)为细胞粘附模型,以人乳及牛乳蛋白质、N-链寡糖组和去糖蛋白质为研究对象,考察了目标底物对鼠伤寒沙门氏菌的抗致病菌粘附作用(细胞培养和平板计数法)。实验结果表明:去糖基化后,人乳和牛乳蛋白的抗致病菌粘附活性都显著降低,证明N-糖基化有助于人乳和牛乳蛋白的抗致病菌粘附活性。人乳和牛乳中释放下来的N-链寡糖对沙门氏菌粘附Caco2细胞均有非常显著的抑制作用;所有乳蛋白样品活性均显著低于N-链寡糖样品。人乳和牛乳蛋白质均有抗致病菌粘附活性且二者活性无显著差异。消化后人乳蛋白样品(无论去糖基化与否)均显著优于牛乳。