论文部分内容阅读
自噬作为保守的细胞防御机制,始终贯穿于细胞的生长、蛋白质代谢、细胞器更新以及机体的生理病理过程。随着技术的发展和研究的深入,自噬基因的发现使自噬的研究在分子水平上取得了巨大的进步。在对酵母和哺乳动物中的自噬相关基因12和16L1的研究显示它们对细胞免疫、病毒复制都有着重要作用。新城疫是高度接触传染性疾病,在宿主体内的复制很大程度上决定于宿主生物的抵抗能力和病毒的逃逸机制。本研究对新城疫天然宿主鸡的ATG12和ATG16L1进行分子克隆、生物学分析并探索它们与细胞因子和病毒复制的关系。1.参照GenBank上发表的人、类人猿、小鼠等基因序列及原鸡的ATG12和ATG16L1预测序列设计引物。以鸡肾脏DNA为模板,克隆出鸡的ATG12和ATG16L12个目的基因。其中ATG12全长441bp,编码的UBQ泛素类蛋白能帮助ATG5和ATG12结合。ATG16L1全长1875bp,主要含有一个WD40超级家族序列,是一个螺旋卷曲的结构,在自噬完成阶段起到形成完整自噬体膜的重要作用。通过检测正常情况和感染新城疫病毒后鸡器官内目的基因的分布和表达量,发现2个基因在正常条件下表达水平都较低但分布广泛。且在感染新城疫病毒后,鸡的脾脏、肺脏、心脏中目的基因表达量显著上升。结果表明,2个目的基因在主要的免疫器官和病毒增殖器官中表达量较多,推测可能在细胞抗病毒和免疫中发挥了作用。2.克隆得到的目的基因连接到pEGFP-N1-3×Flag载体上,获得可转染细胞的质粒,并设计合成siRNA沉默目的基因。用DF-1细胞作为转染细胞,分别过表达和沉默2个目的基因,检测目的基因、细胞因子、病毒表达量和上清中病毒生长曲线。结果显示2个目的基因过表达时大部分下游细胞因子显著下调,沉默时则显著上调。其中过表达ATG12时IFN-β显著下调,而过表达ATG16L1时IFN-γ显著上升,过表达2个目的基因均能提高新城疫病毒的表达量。加入siRNA沉默ATG12时,IFN-β的表达量又显著上调,而沉默ATG16L1时IFN-γ表达量显著下降,且沉默2个基因后新城疫病毒的复制显著减缓。表明鸡ATG12和ATG16L1基因在禽类细胞免疫中发挥了一定的作用,尤其ATG12与IFN-β,ATG16L1与IFN-γ的关系较为密切。且2个目的基因对新城疫病毒的复制均是正向调节作用,能增强新城疫病毒的复制。本论文研究了自噬相关基因12和16L1的生物学功能,探索了目的基因在新城疫病毒复制和细胞因子中发挥的作用,让我们更多从宿主的角度来观察病毒的作用机制。为进一步研究自噬与禽源病毒的相互作用和开发新型抗病毒药提供了新的思路。