目的：利用Pfu高保真DNA聚合酶结合双硫代磷酸化修饰引物，建立能准确和敏感识别高度近视患者ZNF644基因I587V、3’UTR+592G>A2个突变位点的方法，为我们检测和筛查高度近视患者ZNF644基因突变，进一步验证ZNF644基因与高度近视的相关性提供方法学依据。方法：在NCBI Gene数据库中查找到ZNF644基因序列，同时根据文献中所报道的关于ZNF644基因的突变情况，明确其I587V和3’UTR+592G>A两个突变位点所在序列中的位置。提取正常人血液基因组DNA，根据已知ZNF644基因突变I587V、3’UTR+592G>A区域序列，分别设计目的基因序列扩增引物进行引物延伸反应，将其PCR产物克隆到pGEM-T EASY载体，得到ZNF644基因的野生型克隆，再用定点突变方法突变为突变位点的基因突变型克隆，然后以此构建的重组质粒作为研究模板，分别设计3’末端与突变型基因位点或野生型基因位点配对的引物，双硫代磷酸化修饰3’末端并偶联高保真聚合酶构成的基因突变敏感性分子开关，对突变型质粒模板及野生型质粒模板进行引物延伸反应并通过凝胶成像系统对其进行分析。结果：明确了I587V、3’UTR+592G>A2个突变所在的基因序列以及其突变位点所在的位置，克隆出了含目的突变位点的DNA片段，并且定点突变得到了相应突变位点的突变基因型，构建出了含有目的基因的野生型质粒模板和突变型质粒模板。当突变引物对与突变型质粒模板配对时，引物被延伸，有PCR产物；与野生型质粒模板不配对时，引物不能被延伸，无PCP产物。同样，野生引物对只有与野生型质粒模板匹配时得以延伸，而与突变模板不匹配时则不能延伸。结论：pfu高保真聚合酶结合双硫代修饰引物能准确快速地检测高度近视患者ZNF644基因I587V、3’UTR+592G>A2个突变，从而能为我们筛查高度近视患者ZNF644基因突变，验证ZNF644基因与高度近视的相关性提供一种有效的方法。