前言支气管哮喘是以气道可逆性阻塞、气道高反应性和淋巴细胞、嗜酸性粒细胞浸润气道粘膜下层为特征性的慢性气道炎症。关于支气管哮喘气道炎症的发病机制,研究普遍认为主要是免疫源性炎症。多数学者认为CD4+辅助性T淋巴细胞两种亚型(Th1和Th2)的失衡是哮喘发生的重要机制,具体表现为Th2细胞的活化亢进,这是哮喘发病机制中的关键环节。近年来,CD4+辅助性T淋巴细胞的另一种亚型Th17细胞在支气管哮喘发病机制中的作用日益受到重视。Th17区分于Thl和Th2的特点在于其特异性高水平分泌IL-17,是一种新型的促炎CD4+T效应细胞。转化生长因子-p和IL-6是诱导Th17细胞分化的关键因子。目前研究认为Th17细胞产生分泌的IL-17可以通过诱导释放的促炎症因子和促中性粒细胞动员的细胞因子协调局部组织的炎症,在哮喘过敏性气道炎症中发挥重要作用。p-抑制蛋白属于抑制蛋白家族,包括p-抑制蛋白1和p-抑制蛋白2。p-抑制蛋白是众所周知的G蛋白偶联受体的负性调节蛋白,但同时作为支架蛋白和连接蛋白,参与受体在胞内的信号转导。有研究认为p-抑制蛋白2参与过敏性哮喘的发病机制,而且是在炎症反应的上游调节过敏性哮喘的发病。p-抑制蛋白在参与受体在胞内的信号转导时,他们募集内吞蛋白和信号分子与受体结合,从而活化促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路。MAPK信号通路包括ERK1/2, p38和JNK等几条通路,其中ERK1/2是MAPK级联反应中研究最为活跃,也是最为重要的信号传导通路之一。有研究证实在小鼠淋巴结细胞中IL-17的产生和表达可通过促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路调控。p-抑制蛋白2参与过敏性哮喘的发病机制,且是在炎症反应的上游调节过敏性哮喘的发病,那它是否通过调节IL-17的表达和产生而发挥效用呢?β-抑制蛋白可以活化促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路,而在小鼠淋巴结细胞中IL-17的产生和表达可通过促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路调控,且有研究发现β-抑制蛋白2能部分通过活化ERK1/2信号通路刺激IL-6的产生,而IL-6是诱导Thl7细胞分化的关键因子,所以我们假设p-抑制蛋白2可能通过刺激CD4+T细胞表达和产生IL-17参与过敏性哮喘的发病,且其对IL-17的作用可能部分是通过活化ERK1/2信号通路来实现的。由此,本实验分三个部分：(1)建立急性哮喘小鼠动物模型,并证明急性哮喘小鼠模型建立成功；(2)接下来研究急性哮喘小鼠脾源性CD4+T细胞中p-抑制蛋白2表达的变化和p-抑制蛋白2对哮喘小鼠脾源性CD4+T细胞表达和产生IL-17的影响；(3)最后研究p-抑制蛋白2是否通过活化ERK1/2蛋白促进急性哮喘小鼠脾源性CD4+T细胞表达和产生IL-17,从而探讨p-抑制蛋白2促进急性哮喘小鼠脾源性CD4+T细胞表达和产生IL-17的可能机制。本实验希望通过研究p-抑制蛋白2对哮喘小鼠CD4+T细胞表达和产生IL-17的影响及其可能机制为哮喘防治提供新思路和理论依据。第一章急性哮喘小鼠模型的建立与评价目的建立急性哮喘小鼠动物模型,完善急性哮喘小鼠动物模型的评价标准,并鉴定急性哮喘小鼠模型建立是否成功。方法将20只SPF级BABL/c小鼠随机分为两组：急性哮喘组(15只)以OVA致敏、激发；正常对照组(5只)以等体积的PBS代替OVA致敏、激发；两组均在末次激发24h后处理小鼠。处理包括：1.查看小鼠的一般行为活动；2.乙酰甲胆碱激发小鼠后,有创肺阻抗法测定小鼠的气道反应性；3.BALF行细胞学分类、计数；4.观察肺组织的病理变化；5.计算脾源性CD4+T细胞总数。结果(1)急性哮喘组小鼠出现类似于人的哮喘发作症状,而正常对照组小鼠表现基本正常。(2)与正常对照组相比,急性哮喘组小鼠肺阻力(RL)对乙酰甲胆碱的浓度反应曲线明显上移(P<0.01)；急性哮喘组小鼠肺动态顺应性(Cdyn)对乙酰甲胆碱的浓度反应曲线明显下移(P<0.01)。(3)与正常对照组相比,急性哮喘组小鼠肺组织支气管及血管周围大量炎性细胞浸润(P<0.01),气道上皮可见较多黏液分泌。(4)急性哮喘组小鼠BALF白细胞总数及巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞的计数明显高于正常对照组(P均<0.01)。(5)急性哮喘组小鼠脾源性CD4+T细胞数明显高于正常对照组(P<0.01)。结论(1)建立了急性哮喘小鼠动物模型,并且模型鉴定成功；(2)脾源性CD4+T细胞数可以做为急性哮喘小鼠动物模型的评价标准之一。第二章β-抑制蛋白2对急性哮喘小鼠脾源性CD4+T细胞表达和产生IL—17的影响目的探讨急性哮喘小鼠脾源性CD4+T细胞中β-抑制蛋白2和IL-17表达的变化以及β-抑制蛋白2对急性哮喘小鼠脾源性CD4+T细胞表达和产生IL-17的影响。方法首先研磨小鼠脾脏制成单细胞悬液后裂解红细胞,再予免疫磁珠分离小鼠脾源性CD4+T细胞,悬于加有胎牛血清的RPMI1640培养液中。正常对照组和哮喘组小鼠脾源性CD4+T细胞分别加入ConA(?)口PMA刺激培养24小时后行real-time PCR(?)(?)western blot测定细胞中β-抑制蛋白2的表达。再通过基因瞬时转染的方法,将三对siRNA-β-抑制蛋白2片段和阴性对照片段分别转染入急性哮喘小鼠脾源性CD4+T细胞后,RT-PCR检测β-抑制蛋白2mRNA的表达,筛选出其中具有最佳沉默效果的片段。Western blot检测阴性对照组、具有最佳沉默效果片段组哮喘小鼠脾源性CD4+T细胞中β-arrestin2的蛋白的表达。其后小鼠脾源性CD4+T细胞分为正常对照组、哮喘组和转染组(转染最佳沉默片段哮喘组),分别加入ConA(?)(?)PMA刺激培养24小时后行real-time PCR(?)(?)western blot测定细胞中IL-17mRNA和蛋白的表达,ELISA法检测细胞培养上清中IL-17的浓度。结果(1)哮喘组小鼠脾源性CD4+T细胞β-抑制蛋白2mRNA和蛋白的表达高于正常对照组(P均<0.01)；(2)在三对siRNA片段中以siRNA-β-抑制蛋白2-1123沉默效果最为明显(P<0.01)；(3)哮喘组小鼠脾源性CD4+T细胞中IL-17mRNA和蛋白的表达高于正常对照组(P均<0.01)；哮喘组小鼠脾源性CD4+T细胞培养上清中IL-17的浓度高于正常对照组(P<0.01)；(4)转染组哮喘小鼠脾源性CD4+T细胞中IL-17mRNA和蛋白的表达低于哮喘组(P<0.01)；转染组哮喘小鼠脾源性CD4+T细胞培养上清中IL-17的浓度低于哮喘组(P<0.01)结论(1)急性哮喘小鼠脾源性CD4+T细胞中β-抑制蛋白2的表达增高；(2)急性哮喘小鼠脾源性CD4+T细胞中IL-17的表达和产生增高；(3)β-抑制蛋白2促进急性哮喘小鼠脾源性CD4+T细胞IL-17的表达和产生。第三章p-抑制蛋白2促进急性哮喘小鼠脾源性CD4+T细胞表达和产生IL—17的机制研究目的：探讨p-抑制蛋白2是否通过活化ERK1/2蛋白刺激急性哮喘小鼠脾源性CD4+T细胞表达和产生IL-17。方法：本部分实验分两小部分。①为探讨急性哮喘小鼠脾源性CD4+T细胞中p-抑制蛋白2对活化ERK1/2蛋白表达的影响,同第二部分,取正常对照组、哮喘组和转染组小鼠脾源性CD4+T细胞,分别加入ConA和PMA刺激培养24小时后行western blot测定细胞中活化ERK1/2蛋白的表达。②为探讨急性哮喘小鼠脾源性CD4+T细胞中活化ERK1/2蛋白对表达和产生IL-17的影响,取小鼠脾源性CD4+T细胞分三个组：正常对照组、哮喘组和PD98059组(ERK1/2抑制剂PD98059预处理急性哮喘小鼠脾源性CD4+T细胞2小时),ConA和PMA刺激培养24小时后,行real-time PCR和western blot分别检测三组细胞中IL-17mRNA口蛋白的表达,ELISA法检测培养上清中IL-17的浓度。结果：(1)哮喘组小鼠脾源性CD4+T细胞活化ERK1/2蛋白的表达高于正常对照组(P<0.01)；(2)转染组小鼠的脾源性CD4+T细胞中活化ERK1/2蛋白的表达低于哮喘组(P<0.01)；(3)PD98059组哮喘小鼠脾源性CD4+T细胞中IL-17mRNA和蛋白的表达低于哮喘组(P均<0.05)；PD98059组哮喘小鼠脾源性CD4+T细胞培养上清中IL-17的浓度低于哮喘组(P<0.05)。结论：(1)急性哮喘小鼠脾源性CD4+T细胞中活化ERK1/2的表达增高；(2)活化ERK1/2促进急性哮喘小鼠脾源性CD4+T细胞IL-17的表达和产生；(3)p-抑制蛋白2促进急性哮喘小鼠脾源性CD4+T细胞ERK1/2的活化,活化ERK1/2通路是p-抑制蛋白2促进急性哮喘小鼠脾源性CD4+T细胞表达和产生IL-17的机制之-