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一、研究背景近年来肺癌的发病率在全球范围内呈持续上升趋势,而这一趋势在中国尤其明显。据报道,肺癌在我国已经成为发病率和病死率最高的恶性肿瘤,对人群健康构成了严重的威胁。而在肺癌病例中,非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占据了绝大部分。不幸的是,将近80%的NSCLC病人被诊断时已经处于晚期。他们不像早期病人能通过手术等治疗获得较高的生存率,临床上对这些病人的治疗手段也是很有限的。厄洛替尼(erlotinib)作为表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)酪氨酸酶抑制剂(Tyrosine Kinase Inhibitor,TKI)给晚期NSCLC病人,特别是对EGFR敏感突变的病人带来了巨大的希望。但是,几乎所有的病人在用药半年到一年时会产生厄洛替尼耐药。尽管现已发现多种因素参与了耐药的发生,但仍有30%左右的病人耐药的原因尚不清楚。因此,对NSCLC发生EGFR-TKI获得性耐药机制的进一步探索是当前本领域研究的热点之一。Rab25是一种分布在上皮细胞的小GTP酶,其异常表达与包括肺癌等多种恶性肿瘤的发生相关。有文献报道利用基因芯片的方法研究发现Rab25可能与厄洛替尼等3种TKI耐药都相关[1],但其在NSCLC厄洛替尼获得性耐药中的作用和机制有待实验进一步证实。经典的Wnt/β-catenin信号通路参与调控多种肿瘤的增殖分化及转移等生物学行为[2]。研究表明,在肺腺癌NCI-H1650细胞中,EGFR的突变特别是T790M突变能磷酸化并激活β-catenin,从而介导核内反式激活,进而导致细胞对厄洛替尼的敏感性下降[3]。而敲低β-catenin的表达能够明显改善非敏感的肺腺癌H1975细胞对不可逆性TKI(BIBW2992)的敏感性[4]。这些证据都表明,β-catenin在TKI原发和继发性耐药中可能发挥了一定的作用。而β-catenin在PC9/ER细胞中是否也是Rab25介导的厄洛替尼敏感性的下游机制引起了我们的研究兴趣。二、研究目的研究Rab25在厄洛替尼耐药细胞(PC9/ER)与亲本细胞中的表达差异;通过基因敲低手段明确其在NSCLC发生厄洛替尼获得性耐药中的作用,以期为丰富对厄洛替尼耐药的认识提供新思路、新理念。三、研究方法1.在课题组前期诱导获得的耐药细胞PC9/ER基础上,传代培养并比较其与亲本细胞PC9在形态上的差异;利用CCK-8法鉴定PC9/ER细胞的耐药性,并计算耐药指数。2.利用qPCR和Western-Blot比较Rab25在PC9/ER及PC9细胞间基因和蛋白表达水平的差异;利用梯度厄洛替尼浓度刺激两株细胞,比较两者Rab25蛋白水平变化及剂量依赖效应;利用免疫荧光法定位Rab25蛋白在两者细胞定位的不同。3.利用siRNA和慢病毒(LV)转染技术,敲低Rab25在PC9/ER细胞中的表达,研究Rab25敲减对改善厄洛替尼耐药的作用;运用流式细胞仪检测敲减组与对照组的细胞周期变化,明确Rab25敲低对细胞增殖特性的作用。4.在PC9/ER细胞敲低Rab25表达的基础上,用Western-Blot探索Wnt信号通路蛋白的改变状态,并运用激动剂LiCl对信号通路恢复活性以检测PC9/ER细胞对厄洛替尼敏感性的变化。四、研究结果1.传代培养的PC9/ER及PC9细胞,在低倍镜下观察到:PC9细胞呈长梭形,而PC9/ER细胞呈类圆形;高倍镜下观察到:PC9细胞呈散在分布,PC9/ER细胞呈连续片状分布。CCK-8实验表明,PC9/ER细胞的IC50值远高于PC9细胞[(7.85±1.53)μM vs(0.12±0.04)μM,P<0.01)],PC9/ER细胞的耐药指数为68.21±21.42,提示耐药细胞PC9/ER可用于后续实验。2.同等厄洛替尼浓度刺激条件下,Rab25的基因和蛋白表达在PC9/ER细胞均高于PC9细胞(P<0.05);增高的Rab25蛋白主要表达于细胞膜;在PC9及PC9/ER细胞中,Rab25的蛋白水平在0-1μM厄洛替尼之间随刺激浓度的递增而增高。3.成功筛选si Rab25序列并转染PC9/ER细胞并敲低Rab25的表达,敲低组的IC50明显低于对照组[(0.59±0.33)vs(6.14±0.92)μM,P<0.05];敲低组的增殖指数明显低于对照组[(0.53±0.10)vs(0.89±0.06),P<0.05]。4.厄洛替尼作用于PC9/ER细胞后,β-catenin蛋白水平明显高于PC9细胞(P<0.05);免疫荧光实验发现β-catenin主要表达于细胞核;β-catenin和p-GSK-3β蛋白水平在LV-Rab25组低于LV-control组;而Li Cl(10m M)能在细胞浆和细胞核中升高LV-Rab25组细胞的β-catenin表达。五、结论1.Rab25在PC9/ER细胞中高表达,对其厄洛替尼耐药具有促进作用。2.Wnt信号通路的激活,导致β-catenin的核表达增加,在Rab25介导的PC9细胞厄洛替尼耐药发挥了重要作用。