PIF1解螺旋酶在DNA损伤修复中的作用

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目的:利用PIF1敲低细胞系,研究PIF1蛋白与细胞周期及辐射应答之间的关系;构建人PIF1及其C末端解螺旋酶模序(PIF1C)和N末端PINT结构域(PIF1N)截短体真核表达重组质粒,进行真核表达,并确定PIF1、PIF1C、PIF1N在细胞内定位;设计能抑制PIF1的SiRNA序列,构建SiRNA真核表达载体,鉴定为下一步实验做准备;DR-GFP-U2OS细胞模型双键断裂损伤后,分别敲低、过表达PIF1、及其C末端解螺旋酶模序(PIF1C)和N末端PINT结构域(PIF1N)。检测绿荧光变化。明确PIF1在DNA双链断裂损伤中同源重组修复中的作用。方法:HeLa细胞经TDR双阻断后,不同时间点收细胞,流式细胞仪检测细胞周期同步化时相,Westernblot检测PIF1蛋白的变化。HeLa细胞进行60Coγ射线不同剂量照射,按时间点收细胞,Western blot检测PIF1蛋白的变化水平;PIF1敲低细胞系及对照组细胞经TDR双阻断后,分别在不同时间点收细胞,流式细胞仪检测周期各时相细胞所占比例。PIF1敲低细胞系及对照组细胞分别进行4、20Gy照射,照射后分别在0、24h、48h收细胞,流式细胞仪检测细胞凋亡情况;以HeLa cDNA为模板PCR获取PIF1、PIF1C、PIF1N编码区cDNA,将其插入pCMV-Tag2B质粒中构建PIF1、PIF1C、PIF1N真核表达重组质粒;通过lipofectamine2000将重组质粒转染人293细胞中,Western blot方法检测其在真核细胞内的表达,用免疫荧光的方法检测其细胞内定位;将设计好的抑制PIF1的SiRNA序列送公司合成后,Western blot检测,确定敲低序列;将低敲的PIF1siRNA、过表达的PIF1、PIF1C、PIF1N真核表达重组质粒通过lipofectamine2000分别转入DR GFP U2OS细胞中,24h后再分别转入I-SceI的表达质粒,48h后检测绿荧光蛋白的强度变化。结果:双阻断后,PIF1蛋白的含量在S期显著升高。进行60Coγ射线照射后,各剂量PIF1蛋白均有先下降后升高的趋势,2Gy在2h左右蛋白含量下降,4h左右开始升高,,4Gy在2h左右蛋白含量下降,6h左右开始升高,10Gy在2h左右蛋白含量下降,10h左右开始升高;敲低细胞系在G2/M期的含量明显高于对照组,照射后,敲低组细胞凋亡率48h内明显升高;成功构建PIF1及其截短体真核表达重组体,并在真核细胞内成功表达。确定PIF1定位于整个细胞,呈弥散状分布,PIF1解螺旋酶模序主要定位于胞浆中,PIF1PINT结构域主要定位于核周;成功构建了抑制PIF1的SiRNA,并在真核细胞中成功表达;敲低组PIF1的绿荧光强度低于对照组,敲低又过表达PIF1的绿荧光强度较敲低组略有升高,PIF1、PIF1C、PIF1N的绿荧光强度高于对照组,但PIF1、PIF1N的荧光强度相近且高于PIF1C。结论:1.PIF1在细胞周期S期表达量升高,可能与细胞的复制有关。2.PIF1影响细胞周期的G2/M期进程,敲低PIF1细胞周期变慢。3.PIF1调控辐射诱导的细胞凋亡,与辐射应答有关,敲低PIF1导致细胞凋亡率升高。4.真核细胞中成功表达了PIF1、PIF1C、PIF1N,且发现PIF1的PINT结构域对PIF1的入核起重要作用。5.PIF1、PIF1的PINT功能域和解螺旋酶序对DSBs的同源重组修复都有一定的作用,但PIF1的PINT结构域起重要作用。
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