[研究背景]乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,全世界每年新增大约130万病例,同时有45万的病人死于此病,因此其严重危害了女性的健康。临床上,乳腺癌是一种异质性的疾病,由多种不同的生物学类型组成,每种类型都有其特殊的形态、免疫组化特点以及相应的临床行为。乳腺癌的发生、发展是一个复杂的过程,涉及多种转录因子、原癌基因的激活和抑癌基因的失活。远处器官转移是乳腺癌死亡率居高不下的主要原因,已发生远处转移的乳腺癌患者5年生存率低于30%,转移后平均生存时间大约为2年。目前针对乳腺癌转移尚缺乏有效的遏制手段,大量关于转移机制的研究基于实验室研究体系,如建立乳腺癌细胞系并对其分子生物学特性进行研究,由于肿瘤浸润转移发生过程复杂、建立肿瘤恶性进展模型困难,对肿瘤恶行性的许多基础机制仍缺乏充分了解。近年来,所谓的上皮间叶转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)逐渐进入研究者的视野。研究证明,上皮来源的肿瘤细胞向间叶性细胞转化以获得向所在器官间质侵袭的能力,在肿瘤恶性进展过程中发挥极其重要的作用。经过上皮间叶转化,肿瘤细胞丧失上皮细胞特性,如细胞极性、基底膜连接及细胞间连接蛋白等。同时经历细胞骨骼蛋白的重新构建以增强细胞的移动性和侵袭性,脱离其原始部位,侵入所在器官间质,经一系列细胞生物学过程,最终形成远处器官转移。Slug又被称为SNAI2,是脊椎动物特异的Snail相关基因,与SNAI1同属于Snail家族,编码锌指蛋白,是可识别特异序列(CAGGTG)的转录调节因子。Snail家族参与中胚层的形成,神经嵴细胞的形成和迁移,细胞分化,细胞粘附,细胞侵袭,细胞周期的调节和抗凋亡。除了参与正常发育过程,在多个肿瘤中也发现参与上皮间叶转化,作为主要的调节因子,影响一系列基因的表达,包括在细胞粘附过程中影响E-cadherin的表达,在肿瘤的生长和转移过程发挥重要作用药物抵抗是限制乳腺癌化疗有效性的重要原因。研究发现许多肿瘤不仅可以对一种治疗药物产生抗药性,而且还可以对那些结构上、功能上以及作用靶点截然不同的肿瘤治疗药物产生药物抵抗,这种现象被称为“多药耐药”(multidrug resistence, MDR)。乳腺癌发生多药耐药的机制较复杂,而膜糖蛋白的过表达则是重要原因之一。由多药耐药基因1(MDR1)编码而成的P-糖蛋白(P-gp)在乳腺癌的原发性耐药中起到重要的作用。而且研究发现经过药物治疗之后的患者,MDR1/P-gp的表达上调,化疗失败的风险更高。因此调控MDR1/P-gp的表达是逆转乳腺癌多药耐药和提高治疗效果的关键。IMP3(Insulin-like growth factor Ⅱ mRN-binding protein3)是胰岛素样生长因子Ⅱ mRNA结合蛋白家族的一员。在人和鼠胚胎发育早期的上皮、肌肉及胎盘等组织中呈高表达,而在成人良性组织中呈低表达或不表达。该家族成员在胚胎形成早期的RNA运输、稳定、细胞生长和迁移中起着重要作用。IMP3在多种恶性肿瘤中表达,但在邻近良性或正常组织中呈低表达或不表达。IMP3在胚胎发育和肿瘤形成过程中有刺激细胞粘附、迁移及浸润的作用,近期研究发现IMP3可以结合乳腺癌耐药基因(BCRP)而促进肿瘤的耐药,表明IMP3是一种癌胚蛋白,并且在肿瘤的增殖、侵袭、转移及药物抵抗中发挥重要的作用。研究发现IMP3与肿瘤的侵袭转移相关,但其表达与上皮间叶转化的关系尚不清楚。我们的研究在于检测IMP3在乳腺癌中的表达情况,设计过表达或干扰IMP3表达检测上皮指标E-cadherin及间叶指标Vimentin和Slug的表达情况,探讨其在上皮间叶转化中的调控作用以及对乳腺癌侵袭转移的影响。初步分析IMP3与乳腺癌多药耐药基因MDR/P-gp的关系及可能的调控机制。[研究方法]1.选取山东大学齐鲁医院病理科2007年7月～2008年12月期间乳腺浸润性导管癌病例蜡块180例。所有病例经复诊并根据HE切片标记出典型病变范围后,应用组织微阵列打孔仪制成乳腺癌组织芯片蜡块。对组织芯片进行IMP3、E-cadherin、Vimentin及Slug抗体的免疫组化染色,分析乳腺癌组织中IMP3与E-cadherin、Vimentin及Slug的关系。2.设计并合成针对IMP3和Slug的特异性的干扰siRNA,获得pEGFP-C1-IMP3全长表达载体及Slug的克隆载体,并将Slug片段定向插入到pcDNA3.1(+)质粒载体中,构建成稳定表达载体,酶切及测序鉴定后大量扩增。3.将上述IMP3过表达和干扰siRNA分别转染到乳腺癌T47D和MDA-MB-231细胞中,培养48h后,通过qRT-PCR检测MP3, E-cadherin, Vimentin, Slug的mRNA水平的表达情况,应用western blot检测蛋白水平的表达情况；在显微镜下观察细胞形态学的改变；用Transwell小室,检测细胞的迁移和侵袭能力的变化；应用RNA结合蛋白免疫沉淀方法(Ribo-immunoprecipitation assay)验证IMP3蛋白和Slug的mRNA的结合能力。4.分别在231-siRNA-IMP3细胞中转染Slug表达质粒和在T47D-IMP3细胞中转染Slug干扰siRNA,培养48h后,通过qRT-PCR检钡IMP3,E-cadherin,Vimentin, Slug的mRNA水平的表达情况,应用western blot检测蛋白水平的表达情况；用Transwell小室,检测细胞的迁移和侵袭能力的变化。5.将IMP3干扰siRNA转染乳腺癌耐药细胞ADM细胞中,培养48h后,通过qRT-PCR检测各组细胞中IMP3mRNA和MDR1mRNA的表达情况,应用Western blot检测IMP3蛋白和P-糖蛋白表达情况,应用罗丹明外排实验流式细胞术检测P-糖蛋白外排功能,应用MTS法检测细胞对阿霉素、紫杉醇、顺铂和5-氟尿嘧啶的半数细胞抑制浓度(IC50)及相对耐药指数(RR)的改变,评价IMP3干扰对细胞多药耐药性的影响。[实验结果]1.免疫组化结果分析发现,在180例乳腺癌中只有23例表达IMP3,占12.8%；其余157例不表达IMP3,占87.2%。分析IMP3蛋白表达与EMT相关指标的关系发现,IMP3与E-cadherin的表达相关(P=0.042),Spearman相关分析呈负相关(r=-0.163,P=0.029); IMP3也分别与Slug和Vimentin表达相关(P=0.004和P<0.001),且Spearman分析均呈正相关(r=0.27,P<0.001和r=0.366,P<0.001)。2.IMP3在乳腺癌T47D细胞系中低表达,在MDA-MB-231细胞系中高表达。T47D细胞中过表达IMP3,发现在mRNA水平,E-cadherin的表达下调(P<0.05),同时Slug和Vimentin表达上调(P<0.01)。Western blot检测蛋白水平的变化与mRNA水平一致。在MDA-MB-231细胞系中转染IMP3干扰siRNA,mRNA和蛋白水平均发现Slug和Vimentin显著降低而E-cadherin明显升高(P<0.05)。用倒置显微镜观察细胞形态学变化发现,T47D-IMP3细胞变得细长而不紧密,而231-siRNA-IMP3细胞变得紧密而规则。Transwell小室检测细胞的迁移侵袭能力发现,迁移侵袭能力弱的T47D细胞在转染IMP3后迁移侵袭增强；而迁移侵袭能力强的MDA-MB-231细胞在干扰IMP3后迁移侵袭能力下降。3.应用RNA-免疫共沉淀-qPCR检测发现,IMP3蛋白可以与Slug的mRNA直接结合。进一步验证IMP3对Slug的调控作用,在231-siRNA-IMP3细胞中过表达Slug, mRNA和蛋白水平发现可以上调Vimentin的表达并下调E-cadherin的表达,同时能够改变细胞形态学变化,使细胞由规则紧密又变得细长而不紧密,并使细胞的迁移侵袭能力增强；相反,在T47D-IMP3细胞中干扰Slug的表达,可以下调Vimentin的表达和上调E-cadherin的表达,改变细胞形态学变化,降低细胞的迁移侵袭能力。4.ADM细胞转染48h后,IMP3干扰组的IMP3及MDR1mRNA水平均明显降低。Western blot检测结果表明IMP3干扰组细胞2种蛋白的表达水平均明显降低。罗丹明外排实验显示,IMP3干扰后荧光含量与对照组相比均显著升高,荧光强度曲线峰值明显右移,P-gp外排功能降低。MTS法检测细胞对4种化疗药物的耐受性,发现IMP3干扰组细胞对阿霉素、紫杉醇、顺铂和5-氟尿嘧啶的IC50明显降低,相对耐药指数显著下降,耐药性被不同程度逆转。[结论]1.IMP3与E-cadherin表达呈负相关,与Slug和Vimentin表达正相关,提示IMP3在乳腺癌的发生发展过程中与肿瘤细胞的上皮间叶转化(EMT)相关。2.IMP3可以直接结合Slug的mRNA,干扰Slug可以逆转过表达IMP3导致的细胞形态、上皮间叶转化指标及迁移侵袭能力的变化。已知Slug可以通过抑制E-cadherin的转录,诱导上皮间叶转化和转移。提示IMP3可以通过调节Slug的mRNA变化,进而影响肿瘤细胞上皮间叶转化,调节肿瘤的迁移侵袭能力。3.IMP3与MDRl在乳腺癌多药耐药细胞中均呈高表达。干扰IMP3可以抑制MDRl的表达,从而显著降低细胞多药耐药性。4.IMP3可通过调控转录因子Slug-E-cadherin-EMT通路而介导乳腺癌侵袭转移,并能影响MDR1表达而调控乳腺癌多药耐药,其有望成为潜在的提示乳腺癌转移的指标及抑制耐药的治疗靶点。