肝癌是我国最为常见的恶性肿瘤之一，国际抗癌研究中心(IARC)估计每年全球肝癌新发病例约56.4万，肝癌死亡病例约54.9万，其中中国肝癌新发病例30.6万，死亡病例30.0万。由此可见，中国的肝癌发病(死亡)数就占了全球所有肝癌病例的一半还要多。肝癌在我国发病率为癌症中第三位(肺、胃、肝)，其死亡率为第二位(肺、肝、胃)，在各种肿瘤中它的恶性程度很高，对健康的危害是很大的。肝癌的治疗在早期多以手术治疗辅助放化疗，中晚期的肝癌主要以放化疗为主，目前临床的化疗方案多是联合化疗，存在副作用大及耐药增多等现象。IFN-α联合5-FU最早被应用于结肠癌的治疗，并取得了一定的效果。后来这种联合治疗方法被应用于食道癌和胃癌等，均取得了满意的效果。关于IFN-α联合5-FU作用机制的研究报道较少，研究前景广阔。 干扰素(interferon，IFN)是细胞对相关刺激反应时所产生的细胞信号蛋白质，是细胞因子超家族中一个糖蛋白类同源细胞因子家族，称为IFN家族。目前已鉴定出该家族中的3个主要成员：IFN-α、IFN-β和IFN-γ。IFN-α由白细胞和原始淋巴细胞分泌，现已通过基因重组技术生产，并被广泛应用于治疗白血病、淋巴瘤、实体瘤及病毒、原虫、寄生虫和真菌感染，其治疗策略包括使用IFN-α单一治疗、辅助治疗和维持治疗。近期研究表明，IFN-α与其受体结合后，可激活多种信号转导途径，影响肿瘤细胞凋亡信号传导通路，从而发挥其抗肿瘤、抗增殖及免疫调节的生物学功能。 5-FU属于抗代谢抗肿瘤药，能抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶，阻断脱氧嘧啶核苷酸转换成胸腺嘧啶核苷酸，干扰DNA的合成，对RNA的合成也有一定的抑制作用，是恶性肿瘤化学治疗的常用药物。最近的研究发现，5-FU对肿瘤细胞凋亡信号传导也有影响。主要涉及到Fas/FasL、NF-кB和caspase-8、Bcl-2家族、线粒体膜电位等的变化。但在不同细胞系间存在差异，且体外研究发现单独应用5-FU时，效应剂量较大，细胞毒作用明显。 一、研究目的： 本研究以肝癌细胞HepG2.2.15为研究对象，通过IFN-α和5-FU对肝癌细胞凋亡信号传导通路中的Bcl-xL、Fas、Caspase-8和BID及细胞周期调控的研究，揭示两者的作用机制，并确定两者联合应用是否存在协同作用，从而减少5-FU的用量，降低其毒副作用，为临床应用细胞因子和化疗药物联合治疗抗肿瘤、促凋亡提供理论依据。 二、研究方法： (1)用MTT法观察化疗药5-FU和IFN-α对HepG2.2.15细胞增殖的影响，并筛选联合用药的最佳剂量。IFN-α和5-FU单用药组各设立6组不同浓度，作用48小时。根据单用药组的增殖抑制情况选择合适的联合用药组药物浓度，进行动力学观察。 (2)流式细胞术检测药物作用前后肝癌细胞周期和细胞凋亡变化：根据MTT结果筛选合适的药物浓度进行分组：对照组，IFN-α组，5-FU组，IFN-α+5-FU联合用药组。药物作用24h后，观察细胞周期变化；48h后观察细胞凋亡的改变。 (3)流式细胞术检测药物作用前后肝癌细胞表面Fas表达变化：分组情况同(2)，药物作甩48h后收集细胞观察结果。 (4)RT-PCR检测药物作用凋亡抑制基因Bcl-XL表达变化：分组情况同(2)，药物作用48h后收集细胞RT-PCR检测。 (5)WesternBlot检测药物作用前后Caspase-8、BID、Cytc的变化。分组情况同(2)，药物作用72小时后，收集各组细胞提取细胞总蛋白检测。 (6)应用Fluo-3/AM荧光标记技术和激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)检测不同组处理的HepG2.2.15细胞内游离钙离子浓度的改变。 三、实验结果： 1.IFN-α单独应用对HepG2.2.15细胞的增殖抑制作用较弱，最大浓度时对细胞的增殖抑制率仅为17.1％。5-FU单用药组的增殖抑制作用较强，根据实验的结果选择联合用药5-FU的浓度为10μg/mL，IFN-α的浓度为4000U/mL，两药联合应用时对细胞的增殖抑制作用明显增强，与单用药组比较差异显著，P＜0.01，两者存在协同作用。 2.两者联合应用对HepG2.2.15细胞周期的影响表现为与对照组和IFN-α、5-FU单用药组相比，联合用药组G0/G1期细胞比率升高(54.95％、60.08％、72.50％)，S期比率降低(29.04％、18.69％、17.44％)，差异有显著性，P＜0.01；经药物处理48小时后，IFN-α组细胞凋亡率为7.15％±2.23％，5-FU组为20.42％±2.67％，明显高于对照组的4.23％±2.01％，P＜0.05，而联合用药组的细胞凋亡率为25.08％±2.54％，与对照组及IFN-α和5-FU单独应用组相比，细胞凋亡率明显增高，均为P＜0.01。 3.肝癌细胞HepG2.2.15表面Fas的表达较低，仅为1.79％。IFN-α对细胞表面Fas表达没有影响，而5-FU则可提高细胞表面Fas的表达(6.91％)，两者联合应用时细胞表面Fas的表达率升高为8.75％，与对照组和单用药组比较P＜0.01. 4.联合用药组HepG2.2.15细胞Bcl-xL基因的表达较对照组和单药组明显下降；凋亡调控蛋白Caspase-8、Bid的活化增加，Cytc表达增强，联合用药组和对照组及单用药组差异有显著性(P＜0.05)。 5.IFN-α作用于肝癌细胞HepG2.2.1524h后，细胞内钙离子的荧光强度由对照组的11.6±9.3增加到37.1±10.1，差异有统计学意义(P＜0.05)；5-FU组钙离子荧光强度与对照组比较无明显变化。联合用药组的钙离子荧光强度为68.3±9.5，与IFN-α单用药组和对照组比较明显升高，差异有显著性(P＜0.01). 四、结论： 1.IFN-α单独应用时对肝癌细胞的增殖抑制作用较弱，但与5-FU联合应用可显著提高对肝癌细胞的增殖抑制作用。 2.IFN-α和5-FU均可抑制肝癌细胞周期，并促进肝癌细胞的凋亡，其中协同用药组较单药组有更明显的作用，说明IFN-α和5-FU在对肝癌细胞周期影响和促进肿瘤细胞凋亡方面存在着明显的协同作用。 3.在对肝癌细胞表面Fas表达的检测中我们发现，5-FU可在一定程度上提高其Fas的表达，而IFN-α的作用不明显，两者有一定协同作用。 4.在基因水平，我们检测了在内源性凋亡途径中发挥作用的抗凋亡基因Bcl-xL在用药前后的表达变化，发现两种药物均可引起Bcl-xL的表达改变，两药联合时具有协同作用。凋亡相关蛋白Caspase-8、Bid的活化明显增强，Cytc表达增加。说明IFN-α联合5-FU可通过调节两条凋亡信号传导通路促进HepG2.2.15细胞的凋亡。 5.IFN-α联合5-FU可通过增加胞浆中游离钙离子的含量，在肝癌细胞凋亡的早期阶段发挥作用。