目的：　　 人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)是导致新生儿先天畸形和出生缺陷的首要感染因素，其危害巨大，给家庭和社会带来巨大负担。关于HCMV先天感染致病机理的研究已经成为儿科学和人类病毒学领域中一项重要课题。HCMV在宿主细胞内转录表达有一定时序性，不同时期的表达产物可能在病毒复制周期中执行不同功能。认识基因的转录方式及转录调控，对于全面认识HCMV基因生物学功能，进而揭示HCMV致病机理具有重要意义。RL13基因是HCMV基因组中的一员，在成纤维细胞中能够抑制病毒复制，目前RL13基因在临床株中转录本结构尚未明确，本文采用cDNA文库筛选，Northern blot及cDNA末端快速扩增（rapid amplification of cDNA ends，RACE）等实验方法，对RL13基因在一株临床株中的转录情况进行研究。UL141基因位于HCMV UL/b区，是HCMV基因组中一个重要的免疫调节基因。我们在前期研究中发现，在不同分离株中存在多种起始位置不同的UL141基因转录本。这种转录起始位置的差异提示UL141基因不同转录本的表达调控存在差异。本研究采用荧光素酶报告基因表达检测实验，竞争性EMSA及酵母单杂交筛选对UL141基因的转录调控进行了研究。　　 实验材料与方法：　　 一、实验材料　　 所用病毒株为中国医科大学附属盛京医院病毒研究室保存的HCMV临床低传代分离株H和CH;人胚肺成纤维细胞（human embryonic lung fibroblast，HELF）MRC-5购自中科院上海细胞库;HCMV H株晚期cDNA文库及HCMV-人胚肺细胞cDNA酵母表达文库为中国医科大学附属盛京医院病毒研究室构建和保存;DIGNorthern Starter Kit购自Roche公司，3-Full RACE Core Set Ver.2.0及5-Full Race Kit购自TakaRa公司，pGL3荧光素酶报告基因载体质粒、Dual-Luciferase? ReporterAssay System、DNA Purification System及Plasmid DNA Purification System购自Promega公司;引物合成及测序由Invitrogen公司完成;常用实验设备包括Beckman台式低温高速离心机、Bio-rad PCR循环仪、细胞培养箱等;所用数据库及分析软件包括基因组数据库、引物设计软件、序列分析软件等。　　 二、实验方法　　 （一）cDNA文库筛选　　 设计RL13基因特异性引物，运用PCR技术依次从cDNA文库三级、二级、一级模板和单克隆中筛选出含有RL13基因序列的阳性克隆。　　 （二）Northern blot　　 合成RL13基因特异性RNA探针，应用NortheRN blot技术检测RL13基因在病毒感染不同时期的转录时序和转录本的长度。　　 （三）3RACE和5RACE　　 通过3RACE及5RACE获得RL13基因转录本确切的5端及3端序列。　　 （四）荧光素酶报告基因表达检测实验　　 1、构建荧光素酶报告基因载体-转录本非编码序列质粒，研究UL141基因上游非编码序列是否具有启动子活性。　　 2、采用5缺失突变技术，鉴定具有转录调控能力的片段，并确定调控元件核心序列。　　 3、构建调控元件-异源启动子-荧光素酶报告基因质粒，观察调控序列对异源启动子的作用，进一步确定调控元件的调控能力。　　 （五）电泳迁移率实验(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)　　 1、人工合成生物素标记和非标记的调控序列，同时提取MRC-5细胞核蛋白　　 2、按照试剂盒说明书配置体系，孵育20min，同时将非变性聚丙烯酰胺凝胶进行预电泳100V，1h。　　 3、上样后电泳100V，45min。　　 4、电压100V，转膜45min。　　 5、紫外交联10min，逐步洗膜后进行ECL发光，分析结果。　　 （六）酵母单杂交筛选　　 应用人工合成结合同尾酶法构建酵母单杂交系统报道子，转化Y187酵母细胞。扩增HCMV-人胚肺细胞cDNA酵母表达文库并提取质粒，将文库质粒转化至含有报道子的酵母细胞，将含有两种质粒的酵母细胞在适当培养基上培养，从平板上长出的克隆中提取酵母质粒，转化大肠杆菌，鉴定并测序，根据获得的cDNA序列确定与报道子结合的蛋白。　　 结果：　　 一、cDNA文库筛选　　 从cDNA文库中共筛选出20个含有RL13特异序列的阳性cDNA克隆，共包含7种不同长度的转录本，长度分别为3628，3114，2515，2443，1737，1240和1029个核苷酸(nucleotide，nt)。这7种转录本具有相同的3末端，不同的5末端。　　 二、Northern blot检测　　 在H株的感染晚期(late，L) RNA中共检测到8种RL13基因转录本。其中2种转录本（3114nt及2515-2443nt）在病毒感染的早期(early,E)开始出现，晚期(late，L)达到高峰。　　 三、5RACE及3RACE　　 RACE实验结果表明，RL13基因转录本具有相同的3末端和不同的5末端。同HCMV Towne株(No.FJ61628)比较，3末端位于第11717位核苷酸，5末端分别位于第8132，8643，9298，10493，10704和10886位核苷酸，结合3RACE及5RACE结果，RACE实验共鉴定出6种转录本，长度分别为3628，3114，2459，1240，1029和846个核苷酸。　　 四、RL13 ORF基因进化分析　　 进行比对的7株（H，CH，Towne，TB40/E，Toledo，Merlin及AD169）分为3组，RL13开放阅读码框架（Open reading frame，ORF）的一致性在15.7-99.3％之间，其中H株与Towne株的一致性为90.3％。　　 五、荧光素酶报告基因表达检测实验　　 1、UL141基因上游1499bp非编码序列具有启动子活性。　　 2、确定了一个33bp的正调控元件及一个33bp负调控元件。　　 3、证实了调控元件对异源启动子具有调控作用。　　 六、竞争性EMSA实验　　 EMSA结果表明，人胚肺细胞核蛋白中含有正、负调控序列的结合蛋白，此种结合可以被同源序列竞争，说明结合蛋白与调控序列的结合为特异性结合。　　 七、酵母单杂交　　 应用酵母单杂交技术从HCMV-人胚肺细胞cDNA酵母文库中筛选出一些分别可与正、负调控元件相结合的候选转录调节蛋白。　　 结论：　　 通过cDNA文库筛选，Northern blot，RACE等实验证实HCMV RL13基因在E期开始转录，L期转录达到高峰，推测其是L期基因。HCMV RL13基因至少有7种转录本结构，这些转录本均为非拼接结构，具有相同的3末端，不同的5末端，长度分别为3628、3114、2515-2443、1737、1240、1029和846nt。　　 通过荧光素酶报告基因检测实验确定了UL141基因上游非编码区1499bp片段具有启动子活性，并且发现了一个正调控元件及一个负调控元件;通过EMSA证实了正、负调控序列可与MRC-5细胞核蛋白相结合，从而调控UL141基因的转录;通过酵母单杂交技术从文库中筛选出一些候选的转录调节蛋白，为进一步研究奠定了良好的基础。