西藏野生大麦耐旱相关基因HvXTH1的克隆与功能鉴定

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干旱作为一种主要的非生物胁迫,严重影响植物的生长和发育,造成作物产量下降。挖掘耐/抗旱种质,深入研究其作用机理,对提高作物的耐/抗旱能力十分重要。青藏高原一年野生大麦具有丰富的遗传多样性,是生物和非生物胁迫研究重要的种质库。本研究在全基因组水平鉴定、分析HvXTH基因家族的基础上,以课题组已筛选到的耐旱野生大麦XZ5为材料,分离克隆XTH家族成员HvXTH1,采用BSMV-VIGS及同源过表达技术探讨HvXTH1的功能,同时,利用表达谱测序和代谢组分析探讨了HvXTH1介导的西藏野生大麦的耐旱机理。主要研究结果如下:1.通过生物信息学方法对大麦全基因组进行分析,共鉴定到24个HvXTH基因家族成员并对其进化、染色体分布、基因结构及表达进行分析。进化树分析结果显示,HvXTH基因家族可以分为3组:组I/II,组III-A和组III-B,HvXTH15属于祖先组;除了HvXTH15,其他HvXTH家族成员的蛋白结构均含有N-糖基化位点;HvXTH家族成员不均匀的分布在7条染色体上,其中有10个基因位于7号染色体上;基于结构的序列比对结果显示,所有HvXTH蛋白均包含负责催化活性的保守结构域(ExDxE)和两个谷氨酸残基(E);公共数据库RNA-seq分析结果显示HvXTH家族成员在不同时期不同器官有不同的表达模式。2.以西藏野生大麦耐旱基因型XZ5、干旱敏感基因型XZ54和耐旱栽培大麦基因型Tadmor为材料,克隆HvXTH1并对其序列及表达进行分析。序列分析结果表明,Tadmor中HvXTH1的DNA序列与两个野生基因型相比有2个碱基的差异,Tadmor中HvXTH1的启动子序列比XZ5和XZ54多两个顺式作用元件,氨基酸序列分析显示HvXTH1包含Glycohydro16和XETC两个功能域。进化树分析结果显示HvXTH1与小麦TaXTH2最为接近;亚细胞定位结果显示HvXTH1定位于细胞膜。组织表达结果显示HvXTH1在根、茎、叶中均表达,其中在叶片中表达量最高;激素响应结果表明,HvXTH1在XZ5、XZ54和Tadmor中对不同激素的响应不同,6-BA和GA3显著诱导XZ5中HvXTH1的表达,Tadmor中HvXTH1在2,4-D、6-BA和BR处理后显著上调;对XZ5进行不同浓度的PEG模拟干旱处理,HvXTH1表达分析结果显示,HvXTH1对5%PEG 6000响应最敏感。3.采用BSMV-VIGS和同源过表达技术探讨了HvXTH1的功能。采用BSMV-VIGS成功沉默XZ5中的HvXTH1,qRT-PCR检测显示,BSMV:HvXTH1植株中HvXTH1的表达量下降82.8%;与BSMV:γ(对照)植株相比,PEG模拟干旱条件下,BSMV-VIGS诱导HvXTH1基因沉默植株(BSMV:HvXTH1)受干旱胁迫生长抑制较轻,植株的根系和地上部鲜重分别显著高25.2%和9.2%;叶片失水率变低,叶片失水更慢。对大麦品种Golden Promise的幼胚进行农杆菌介导的遗传转化,获得HvXTH1过表达植株HvXTH1-OX,qRT-PCR结果显示,HvXTH1过表达植株中HvXTH1的表达量上调7.8倍。在PEG模拟干旱处理条件下,与对照植株(Golden Promise)相比,HvXTH1-OX植株的地上部鲜重显著减少,气孔开度变大,叶片散失水分更快。4.以HvXTH1-OX和Golden Promise为材料,PEG 6000模拟干旱处理,以基本培养液为对照。采用BGISEQ-500进行表达谱测序,分析比较HvXTH1-OX和Golden Promise茎叶响应干旱胁迫的表达谱差异,结果表明,与Golden Promise相比,干旱胁迫导致HvXTH1过表达植株中ABA相关基因如WRKY、LHCB、PIF等的下调表达;采用LC-MS技术分析叶片代谢物的差异,结果发现HvXTH1过表达植株差异代谢物与苯丙氨酸和酪氨酸的生物合成和代谢有关,通过分析这些差异表达基因和代谢物探讨了HvXTH1在植物响应干旱中的调控机制。
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