离心操控的微液滴快速生成新方法及其在单分子单细胞核酸分析中的应用

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核酸是遗传信息的载体,在人类的生命过程中扮演着重要角色。分子水平的核酸研究可以揭示生理过程中反应机理,而细胞水平的核酸研究可以区分细胞间的异质性,为细胞的功能行使提供重要的理论依据。数字PCR技术的出现成功实现了高灵敏度、准确度,特异性与重现性的核酸绝对定量检测,为单分子水平的核酸检测提供了技术保障。而最近发展起来的液滴内单细胞全基因组扩增方法(emulsion whole-genome amplification,eWGA)解决了传统扩增方法在基因组覆盖度、扩增偏差、扩增错误率和环境DNA污染方面的不足,该方法与二代测序相结合可以更准确地实现单细胞的基因拷贝数变异与结构变异分析。数字PCR和eWGA方法的基础之一是大规模均一的小体积反应单元构建,微流控液滴技术的出现刚好解决了这一核心问题。但是传统的液滴生成方法存在样品浪费、耗时长,操作困难等一系列问题。针对传统液滴生成方法的不足,我们发展了一种基于离心力驱动液滴生成的微流控芯片。使用该芯片通过简单的加样和离心操作即可在1 min内实现几十万个均一稳定的微液滴生成,同时不存在样品的浪费。液滴的体积仅由通道宽度和深度的决定,因此更容易操控。通过在此芯片上进行原位数字PCR,我们成功实现了核酸单分子的绝对定量检测,其检测结果与金标法荧光实时定量PCR一致。进一步通过在此芯片上进行eWGA,我们成功实现了单个胶质瘤干细胞的全基因组扩增及测序。同时在液滴荧光动力学检测与测序数据分析两个方面对eWGA在提高基因组覆盖度、减小扩增偏差,降低环境DNA污染等方面的优势进行了考察与表征。基于离心式微液滴生成技术有望进一步推动微液滴在物理,化学和生物医学方面的研究应用。
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