ZmKRP6、ZmKRP8对玉米胚乳细胞发育的影响

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玉米(Zea mays L.)作为世界主要粮食作物之一,在食品、饲料和工业原料方面都具有重要地位。玉米籽粒中胚乳所占比重约为80%,胚乳的发育情况对玉米的产量和品质有直接影响。在禾本科作物的研究中发现,细胞周期蛋白依赖性激酶(Cyclin-dependent kinases,CDK)和周期蛋白(Cyclin)所形成的蛋白复合体会对胚乳发育产生重要调控作用。CDKs蛋白活性抑制因子(Inhibitor/interactor of Cdc2kinases,ICK)又称为激酶相关蛋白(Kip-related Proteins,KRP),该家族蛋白通过与CDKs和Cyclins形成的蛋白复合体相结合抑制细胞周期进展,影响细胞分裂,进而对细胞发育产生影响。但目前关于KRPs家族蛋白在玉米胚乳发育过程中的调控机制的相关研究还十分有限。因此,KRPs家族蛋白的功能及相关分子机制的解析对进一步提高玉米产量,改善玉米品质具有重要意义。本研究以玉米KRPs家族基因中基因结构相似,同源性较高的ZmKRP6和ZmKRP8为主要研究对象,研究ZmKRP6和ZmKRP8基因对胚乳细胞发育的影响以及对玉米产量与品质的影响。具体研究结果如下:1、利用从Maize GDB所获得的zmkrp6和zmkrp8杂合Mu突变体与野生型自交系W22进行多代回交后自交,得到突变位点单一的zmkrp6和zmkrp8纯合突变体材料;zmkrp6和zmkrp8纯合突变体材料间杂交后自交,获得zmkrp6/8双基因突变体;构建CRISPR-Cas9转基因载体,采用农杆菌侵染玉米幼胚获得ZmKRP6和ZmKRP8基因敲除植株。2、通过qPCR检测指示基因ZmE2F5转录水平,间接研究玉米自交系W22、zmkrp6和zmkrp8纯合突变体中ZmCDKA1激酶活性的变化。结果表明:在zmkrp6和zmkrp8突变体中,指示基因ZmE2F5转录水平下降,表明ZmCDKA1激酶活性上升;叶片原生质体中过表达ZmKRP6和ZmKRP8,ZmE2F5转录水平上调,表明ZmCDKA1激酶活性受到抑制,说明ZmKRP6和ZmKRP8能够抑制ZmCDKA1激酶活性。3、以玉米野生型自交系W22、zmkrp6和zmkrp8纯合突变体为材料,观察授粉后早期籽粒表型和进行细胞学观察。结果表明:授粉后早期,zmkrp6和zmkrp8的粒长极显著增加,粒宽无明显差异;细胞学观察显示,授粉后5-9天(Days after pollination,DAP),zmkrp6和zmkrp8胚乳细胞相比于野生型体积显著增大。4、对玉米野生型自交系W22、zmkrp6和zmkrp8纯合突变体成熟籽粒考种分析发现:成熟zmkrp6籽粒的粒长、粒宽相比野生型籽粒显著增加,粒厚无明显变化,zmkrp8籽粒相比野生型籽粒,粒长、粒宽和粒厚均无显著差异;zmkrp6和zmkrp8的百粒重相比野生型均极显著增加;与野生型果穗相比,zmkrp6和zmkrp8各项指标均无显著差异。5、以玉米野生型自交系W22、zmkrp6和zmkrp8纯合突变体以及zmkrp6/8双基因突变体纯合籽粒为材料测定胚乳淀粉的动态变化。结果表明:与野生型相比,zmkrp6籽粒的淀粉积累速率加快,而zmkrp8的淀粉积累速率减缓,但均不影响胚乳中淀粉的终含量。zmkrp6/8双基因突变对胚乳中淀粉含量也无显著性影响。综合以上研究结果初步证明,ZmKRP6、ZmKRP8能够通过抑制ZmCDKA1激酶的活性从而调控玉米胚乳的细胞周期,ZmKRP6、ZmKRP8基因的突变能够促进玉米籽粒增大,提高玉米产量。
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