卵巢癌是死亡率排列于首位的妇科恶性肿瘤,其居较高的死亡率主要和卵巢癌的转移有关。卵巢位于盆腔内,解剖位置比较深,同时发病隐匿,早期无特异性症状,而且缺乏行之有效的实验室检测手段,因此难于早期发现并诊断。大约70%的卵巢癌患者首次诊断时已经发生腹腔或者远处转移。卵巢癌“二元论模型”认为,卵巢癌分为高级别和低级别两类。高级别卵巢上皮性癌占卵巢癌发病的75%,占卵巢癌病死率的90%,其发病迅速,侵袭性极强,常伴发广泛的盆腹腔转移和种植,预后极差。而低级别卵巢上皮性癌发病缓慢,多经历良性、交界性和低度恶性的发展过程,多为早期,预后较好。因此高级别卵巢上皮性癌由于极易发生侵袭和转移,是威胁妇女健康的恶性肿瘤。然而其发生侵袭和转移的机制不明。E3泛素连接酶MARCH7是膜相关锌指蛋白家族(RING-CH)的一员。目前研究发现MARCH7参与精子发育和微管蛋白泛素化。微管在细胞运动、肿瘤侵袭以及自噬中具有重要作用,所以我们推测MARCH7可能在肿瘤中扮演重要的角色。目前尚无MARCH7在肿瘤中的研究。因此,本课题将探索MARCH7在上皮性卵巢癌中的作用和机制,以期探讨MARCH7在上皮性卵巢癌恶性生物学行为中的可能分子机制,为MARCH7在卵巢癌中的作用以及精准治疗提供理论依据和基础。第一部分MARCH7在上皮性卵巢肿瘤中的表达及其意义目的检测在上皮性卵巢癌组织中,MARCH7蛋白表达情况,探讨MARCH7的表达与上皮性卵巢癌患者临床病理参数之间的关系。方法采用免疫组织化学测定20例正常卵巢组织,138例上皮性卵巢癌组织标本中MARCH7的表达情况,分析MARCH7的表达与其临床病理特征的相关性;q PCR检测MARCH7 m RNA在卵巢癌细胞株(A2780,C30,COC1,COC1/DDP,ES-2,OVCA3WT,SKOV3)中的表达情况。结果(1)MARCH7在上皮性卵巢癌组织的表达明显比正常卵巢组织增高(P<0.05)。MARCH7主要定位在细胞膜和细胞质。MARCH7在浆液性卵巢癌的表达和其他上皮性卵巢癌(粘液性卵巢癌和子宫内膜样腺癌)比较无统计学意义(P>0.05)。MARCH7在晚期卵巢癌(III/IV期)表达明显比早期卵巢(I/II期)癌高,差异有统计学意义(P<0.001)。同时,MARCH7的表达和卵巢癌分级有关系,分级越高,表达越高(2-3级别和1级比较)(P<0.05)。但是,MARCH7的表达和年龄无关((P>0.05)。(2)MARCH7 m RNA在卵巢癌SKOV3,ES-2和OVCA3WT中表达明显高于A2780细胞;结论MARCH7在上皮性卵巢癌组织中表达增高,同时MARCH7的表达和卵巢癌的分期、分级有关系。第二部分MARCH7对卵巢癌A2780和SKOV3细胞株恶性行为的影响目的探索沉默或者过表达MARCH7基因后对卵巢癌细胞株SKOV3和A2780细胞细胞增殖、转移、侵袭、细胞骨架和生长等恶性生物学行为的影响。方法(1)采用CCK-8,Ed U细胞增殖实验和克隆形成实验检测卵巢癌A2780和SKOV3细胞株在过表达或沉默MARCH7基因后的增殖情况;(2)采用划痕实验和Transwell小室检测测卵巢癌A2780和SKOV3细胞株在过表达或沉默MARCH7基因后的转移和侵袭能力的变化;(3)采用F-actin(鬼笔环肽)染色检测卵巢癌A2780和SKOV3在过表达或沉默MARCH7基因后细胞骨架的改变;(4)采用裸鼠皮下移植瘤实验观察SKOV3细胞沉默MARCH7基因后以及A2780细胞过表达MARCH7基因后成瘤能力的变化。结果(1)SKOV3细胞沉默MARCH7基因后,细胞增殖能力降低;A2780细胞中过表达MARCH7基因后,细胞增殖能力增强。CCK-8结果显示:卵巢癌SKOV3细胞株感染慢病毒携带的MARCH7基因sh RNA后的第1、2、3、4和5天呈现的细胞生长曲线,LV3-sh MARCH7-1和LV3-sh MARCH7-2组与对照组LV3-NC组比较,细胞生长速度减慢(P<0.05)。卵巢癌A2780细胞株感染MARCH7过表达慢病毒载体的第1、2、3、4和5天呈现的细胞生长曲线,LV5-MARCH7和对照组LV5-GFP组比较,细胞生长速度增快(P<0.05)。Ed U细胞增殖实验显示:卵巢癌SKOV3细胞株感染慢病毒携带的MARCH7基因sh RNA后,LV3-sh MARCH7-1和LV3-sh MARCH7-2组与对照组LV3-NC组比较,Ed U细胞阳性率明显降低(P<0.05)。卵巢癌A2780细胞株感染MARCH7过表达慢病毒载体后,LV5-MARCH7和对照组LV5-GFP组比较,Ed U细胞阳性率明显增加(P<0.05)。克隆形成实验显示:卵巢癌SKOV3细胞株感染慢病毒携带的MARCH7基因sh RNA后,LV3-sh MARCH7-1和LV3-sh MARCH7-2组与对照组LV3-NC组比较,细胞生长迟缓,形成克隆数目明显减少(P<0.05)。卵巢癌A2780细胞株感染MARCH7过表达慢病毒载体后,LV5-MARCH7和对照组LV5-GFP组比较,细胞生长增快,形成克隆数目明显增多(P<0.05)。(2)划痕实验结果显示:卵巢癌SKOV3细胞株感染慢病毒携带的MARCH7基因sh RNA后,LV3-sh MARCH7-1和LV3-sh MARCH7-2组与对照组LV3-NC组比较,细胞迁移能力降低(P<0.05)。卵巢癌A2780细胞株感染MARCH7过表达慢病毒载体后,LV5-MARCH7和对照组LV5-GFP组比较,细胞迁移能力增强(P<0.05)。Transwell小室侵袭实验结果显示:卵巢癌SKOV3细胞株感染慢病毒携带的MARCH7基因sh RNA后,LV3-sh MARCH7-1和LV3-sh MARCH7-2组与对照组LV3-NC组比较,细胞侵袭能力降低(P<0.05)。卵巢癌A2780细胞株感染MARCH7过表达慢病毒载体后,LV5-MARCH7和对照组LV5-GFP组比较,细胞迁移侵袭增强(P<0.05)。(3)卵巢癌SKOV3细胞株感染慢病毒携带的MARCH7基因sh RNA后,LV3-sh MARCH7-1和LV3-sh MARCH7-2组与对照组LV3-NC组比较,细胞膜褶皱和板状伪足减少。卵巢癌A2780细胞株感染MARCH7过表达慢病毒载体后,LV5-MARCH7和对照组LV5-GFP组比较,细胞板状伪足和细胞膜褶皱增加。(4)卵巢癌SKOV3细胞株感染慢病毒携带的MARCH7基因sh RNA后,LV3-sh MARCH7-1组和对照组LV3-NC组比较,裸鼠皮下移植瘤体积减小,重量降低(P<0.001)。卵巢癌A2780细胞株感染MARCH7过表达慢病毒载体后,LV5-MARCH7和对照组LV5-GFP组比较,裸鼠皮下移植瘤体积增加,重量升高(P<0.001)。结论卵巢癌SKOV3细胞株沉默MARCH7基因表达后,细胞增殖、转移和侵袭能力降低;卵巢癌A2780细胞株过表达MARCH7基因后,细胞增殖、转移和侵袭能力增强。第三部分MARCH7在上皮性卵巢癌恶性行为中的机制研究目的探究MARCH7在上皮性卵巢癌增殖以及侵袭转移恶性行为中可能涉及的机制。方法(1)q PCR检测TGF-β,IL-1β,TNF-α对卵巢癌SKOV3细胞株MARCH7 m RNA表达的影响;Western blot检测TGF-β,IL-1β,TNF-α对卵巢癌SKOV3细胞株中MARCH7蛋白表达的影响;(2)双荧光素酶报告基因检测系统检测卵巢癌SKOV3细胞株沉默或者卵巢癌A2780细胞株过表达MARCH7基因后,NF-κB,Topflash,P53,Stata3和Notch信号通路Reporter活性的变化;(3)Western blot检测卵巢癌SKOV3细胞株沉默或者卵巢癌A2780细胞株过表达MARCH7基因后,NF-κB P50,NF-κB P65,β-catenin和E-Cadherin的表达情况;(4)加入NF-κB通路抑制剂PDTC或者沉默NF-κB P50和NF-κB P65后,MARCH7 m RNA和蛋白水平的变化;(5)免疫荧光检测SKOV3细胞株沉默或者卵巢癌A2780细胞株过表达MARCH7基因后,NF-κB P50,NF-κB P65和β-catenin的入核情况;(6)卵巢癌SKOV3细胞株沉默或者卵巢癌A2780细胞株过表达MARCH7基因后,q PCR检测LEF1,MYC和SP5 m RNA的表达情况;(7)采用免疫组织化学检测过表达和沉默MARCH7基因后,裸鼠移植瘤中MARCH7,NF-κB P50,NF-κB P65,β-catenin的表达情况。结果(1)和对照组(0ng/m L)比较,10ng/m L TGF-β1刺激卵巢癌SKOV3细胞株48小时后,MARCH7 m RNA和蛋白表达水平上调,随着TGF-β1浓度增加(20和30 ng/m L)MARCH7 m RNA和蛋白水平表达降低。和TGF-β1对MARCH7表达调控一致,IL-1β和TNF-α在10ng/m L时,对MARCH7 m RNA和蛋白表达水平上调,浓度增加(20和30 ng/m L)MARCH7 m RNA和蛋白水平表达反而降低。(2)卵巢癌A2780细胞株感染MARCH7过表达慢病毒载体后,LV5-MARCH7和对照组LV5-GFP组比较,NF-κB,Topflash,Stata3和Notch信号通路Reporter活性增强,P53信号通路Reporter活性降低(P<0.001)。卵巢癌SKOV3细胞株感染慢病毒携带的MARCH7基因sh RNA后,LV3-sh MARCH7-1和LV3-sh MARCH7-2组与对照组LV3-NC组比较,NF-κB和Topflash,信号通路Reporter活性明显减弱(P<0.05)。(3)卵巢癌SKOV3细胞株感染慢病毒携带的MARCH7基因sh RNA后,LV3-sh MARCH7-1和LV3-sh MARCH7-2组与对照组LV3-NC组比较,NF-κB P50,NF-κB P65和β-catenin表达下调,E-Cadherin表达上调(P<0.05)。卵巢癌A2780细胞株感染MARCH7过表达慢病毒载体后,LV5-MARCH7和对照组LV5-GFP组比较,NF-κB P50,NF-κB P65和β-catenin表达上调,E-Cadherin表达下调(P<0.05)。(4)加入NF-κB通路抑制剂PDTC后(10u M,30u M和50u M),卵巢癌SKOV3细胞株MARCH7 m RNA和蛋白水平表达降低,随着浓度增加降低越明显(P<0.05)。单独沉默NF-κB P50或NF-κB P65后,MARCH7 m RNA和蛋白水平表达降低;同时沉默NF-κB P50和NF-κB P65后,MARCH7 m RNA和蛋白水平表达进一步降低(P<0.05)。(5)卵巢癌SKOV3细胞株感染慢病毒携带的MARCH7基因sh RNA后,LV3-sh MARCH7-1和LV3-sh MARCH7-2组与对照组LV3-NC组比较,NF-κB P50,NF-κB P65和β-catenin的入核减少。卵巢癌A2780细胞株感染MARCH7过表达慢病毒载体后,LV5-MARCH7和对照组LV5-GFP组比较,NF-κB P65和β-catenin的入核增加。(6)卵巢癌SKOV3细胞株感染慢病毒携带的MARCH7基因sh RNA后,LV3-sh MARCH7-1和LV3-sh MARCH7-2组与对照组LV3-NC组比较,LEF1,MYC和SP5 m RNA的表达降低(P<0.05)。卵巢癌A2780细胞株感染MARCH7过表达慢病毒载体后,LV5-MARCH7和对照组LV5-GFP组比较,LEF1,MYC和SP5 m RNA的表达降低增高(P<0.05)。(7)免疫组化结果显示,卵巢癌SKOV3细胞株感染慢病毒携带的MARCH7基因sh RNA后,LV3-sh MARCH7-1和对照组LV3-NC组比较,MARCH7,NF-κB P50,NF-κB P65,β-catenin的表达降低(P<0.05)。卵巢癌A2780细胞株感染MARCH7过表达慢病毒载体后,LV5-MARCH7和对照组LV5-GFP组比较,MARCH7,NF-κB P50,NF-κB P65,β-catenin的表达上调(P<0.05)。结论MARCH7可能是通过激活NF-κB和Wnt/β-catenin信号通路来促进上皮性卵巢癌增殖、侵袭和转移。MARCH7可能是NF-κB和Wnt/β-catenin信号通路的一个潜在的调节因子。第四部分miR-101靶向MARCH7对卵巢癌SKOV3细胞株恶性行为的影响目的研究miR-101对MARCH7的调控作用以及对卵巢癌SKOV3细胞株的恶性生物学行为的影响。方法(1)通过生物信息学预测miR-101和MARCH7 m RNA 3’UTR相互结合的位点(http://www.targetscan.org/);(2)转染miR-101 mimics,检测MARCH7 m RNA和蛋白水平的变化情况;(3)共转染miR-101和MARCH7 m RNA 3’UTR结合靶点载体(p MIR-MARCH73’UTR)以及突变体(MIR-MARCH73’UTRm),双荧光素酶报告基因检测系统检测转染miR-101 mimics后荧光素酶活性的变化;(4)转染miR-101 mimics,检测卵巢癌SKOV3细胞株增殖、转移和侵袭能力变化;同时感染MARCH7过表达慢病毒载体后,检测巢癌SKOV3细胞株增殖、转移和侵袭能力变化。结果(1)生物信息学预测到miR-101和MARCH7 m RNA 3’UTR有潜在的结合位点;(2)转染miR-101 mimics后,卵巢癌SKOV3细胞株MARCH7 m RNA和蛋白水平表达明显降低(P<0.001);(3)和对照组比较,共转染miR-101 mimics和p MIR-MARCH73’UTR后,荧光素酶活性明显下降(P<0.05);和对照组比较,共转染miR-101mimics和MIR-MARCH73’UTRm后,荧光素酶活性无明显改变(P>0.05);(4)转染miR-101 mimics后,卵巢癌SKOV3细胞株增殖能力、转移能力和侵袭能力均降低(P<0.05);同时感染MARCH7过表达慢病毒载体后,卵巢癌SKOV3细胞株增殖能力、转移能力和侵袭能力部分恢复(P<0.05)。结论miR-101可以通过靶向MARCH7调控卵巢癌增殖、转移和侵袭。